Funktionsförlust i den embryonala kycklingnäthinnan med hjälp av tol2-transposonmedierat transgent uttryck av artificiella mikroRNA
Summary
Vi har utvecklat en ny metod för förlust av funktion som involverar introduktion och genomisk integration av artificiella mikro-RNA-sekvenser i kycklingembryon genom att använda ovo-elektroporering och Tol2-transposonsystemet. Denna teknik ger en robust och stabil metod för att studera genernas funktion under utvecklingen.
Abstract
Kycklingnäthinnan har länge varit ett viktigt modellsystem inom utvecklingsneurobiologin, med fördelar som dess stora storlek, snabba utveckling och tillgänglighet för visualisering och experimentella manipulationer. Dess största tekniska begränsning hade dock varit bristen på robusta metoder för att förlora funktionen för analys av genfunktioner. Detta protokoll beskriver en metod för nedtystning av gener i den växande kycklingnäthinnan som involverar transgent uttryck av artificiella mikroRNA (miRNA) med hjälp av Tol2-transposonsystemet. I detta tillvägagångssätt introduceras en Tol2-transposonplasmid som innehåller en expressionskassett för EmGFP-markören (smaragdgrönt fluorescerande protein) och artificiella pre-miRNA-sekvenser mot en målgen i den embryonala kycklingnäthinnan med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion genom in ovo-elektroporering . I de transfekterade näthinnecellerna katalyserar transposaset excisionen av expressionskassetten från transposonvektorn och dess integration i värdkromosomerna, vilket leder till ett stabilt uttryck av miRNA och EmGFP-proteinet. I vår tidigare studie har vi visat att uttrycket av Nel, ett glykoprotein som utövar flera funktioner i neural utveckling, kan undertryckas signifikant i den växande kycklingens näthinna genom att använda denna teknik. Våra resultat indikerar att denna metodik inducerar en stabil och robust hämning av genuttryck och därmed ger en effektiv metod för att förlora funktionen för studier av näthinnans utveckling.
Introduction
Näthinnan hos ryggradsdjur är ett viktigt modellsystem för att studera neural utveckling. Trots sitt perifera läge är näthinnan anatomiskt och utvecklingsmässigt en förlängning av det centrala nervsystemet, och synnerven, som består av axoner av retinala ganglieceller, representerar en kanal i det centrala nervsystemet. Kycklingnäthinnan har betydande fördelar som modellsystem för att studera den molekylära mekanismen för neural utveckling: Den är stor och utvecklas snabbt; Den har strukturella och funktionella likheter med den mänskliga näthinnan; Den är mycket tillgänglig för visualisering och experimentella manipulationer. Molekylära mekanismer för cellproliferation och differentiering, morfogenes och axonstyrning under neural utveckling har studerats utförligt med hjälp av kycklingnäthinnan.
Under de senaste två decennierna har elektroporation använts framgångsrikt för att föra in ektopiska gener i celler i det växande kycklingembryot. Denna teknik möjliggör märkning av celler under utveckling, spårning av cellers öde och spårning av cellmigration och axonvägar, samt ektopiskt genuttryck för in vivo-analys av genfunktion. Förutsättningarna för in ovo-elektroporering för effektivt ektopiskt genuttryck i kycklingembryon är väl etablerade 1,2,3.
Trots dessa fördelar hade avsaknaden av en stabil teknik för studier av genernas funktion varit en stor teknisk begränsning för kycklingembryot. Medan kycklingembryon som elektroporerats med små interfererande RNA (siRNA)4 eller expressionsvektorer för korta hårnåls-RNA (shRNA)5 uppvisar nedbrytning av den riktade genen, är gensuppression i dessa metoder övergående eftersom effekterna försvinner när cellerna förlorar de introducerade RNA eller DNA:erna. En mer stabil gensuppression kan uppnås genom att leverera siRNA till kycklingembryon med ett RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem6. Virusvektorn integreras i värdgenomet och de ektopiska generna uttrycks stabilt. Retroviruset kan dock endast integreras i genomet hos celler som delar sig under den mitotiska fasen (M) av cellcykeln, vilket kan medföra en begränsning av de utvecklingsstadier och/eller celltyper för vilka denna metod för funktionsförlust kan tillämpas. Dessutom verkar uttrycket av transgener av RCAS långsammare och mindre robust än det som induceras av in ovo-elektroporering 7.
Transposoner är genetiska element som rör sig från en plats på genomet till en annan. Tol2-elementet är en medlem av hAT-familjen för transposabla element och innehåller en intern gen som kodar för ett transposas som katalyserar transposonreaktionen av Tol2-elementet8. När en plasmidvektor som bär en genuttryckskassett flankerad av sekvenserna i vänster och höger ände av Tol2-elementen (200 bp respektive 150 bp) förs in i celler hos ryggradsdjur med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion, skärs expressionskassetten ut från plasmiden och integreras i värdgenomet, vilket stöder ett stabilt uttryck av den ektopiska genen (Figur 1). Det har visat sig att det transposabla Tol2-elementet kan inducera gentransponering mycket effektivt i olika ryggradsdjur, inklusive zebrafisk9,10, grodor11, kycklingar12 och möss13, och därmed är en användbar metod för transgenes och insertionsmutagenes. Tol2-transposonsystemet har framgångsrikt använts för betingad knockdown av en målgen genom genomisk integration av siRNA som bearbetas från långt dubbelsträngat RNA14.
Detta protokoll beskriver en funktionsförlust i kycklingembryot som involverar införandet av artificiella mikroRNA (miRNA) av Tol2-transposonsystemet15,16. I detta tillvägagångssätt klonas en expressionskassett för EmGFP-markören (emerald green fluorescent protein) och artificiella miRNA mot en målgen till en Tol2-transposonvektor. Tol2-transposonkonstruktionen introduceras sedan i den embryonala kycklingnäthinnan med en Tol2-transposasuttryckskonstruktion genom in ovo-elektroporation. I de transfekterade näthinnecellerna katalyserar transposaset excisionen av expressionskassetten från transposonvektorn och dess integration i värdkromosomerna, vilket leder till ett stabilt uttryck av miRNA och EmGFP-proteinet. I våra tidigare studier har vi lyckats slå ner uttrycket av Nel, ett extracellulärt glykoprotein som främst uttrycks i nervsystemet, i den växande näthinnan hos kycklingar (se representativa resultat). Våra resultat tyder på att stabil och effektiv gensuppression kan uppnås i ovo med denna teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger en detaljerad guide till nedtystning av gener i den utvecklande kycklingnäthinnan genom transgent uttryck av artificiella miRNA med hjälp av ovo-elektroporering och Tol2-transposonsystemet.
Följande faktorer är av avgörande betydelse för att utföra denna teknik framgångsrikt. För det första är det viktigt att använda miRNA-sekvenser som är bekräftade att utöva robusta knockdown-effekter. Innan du applicerar dem för in ovo-elektroporering , …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vektorerna pT2K-CAGGS och pCAGGS-T2TP tillhandahölls av Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) respektive Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi tackar Michael Berberoglu för hans avgörande läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av anslag från Royal Society och Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Storbritannien) till M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
