Anvendelse af ultralyd og forskydning bølge elastografi Imaging i en rotte model af NAFLD / NASH
Summary
Denne protokol beskriver brugen af en forbedret ultralydsteknik til ikke-invasivt at observere og kvantificere levervævsændringer i gnavermodeller af ikke-alkoholisk fedtleversygdom.
Abstract
Nonalholic Steatohepatitis (NASH) er en tilstand inden for spektret af ikke-alkoholisk fedtlever sygdom (NAFLD), som er karakteriseret ved leverfedt ophobning (steatose) og betændelse, der fører til fibrose. Prækliniske modeller, der nøje opsummerer human NASH/NAFLD, er afgørende for lægemiddeludviklingen. Mens leverbiopsi er i øjeblikket guldstandarden til måling af NAFLD / NASH progression og diagnose i klinikken, i det prækliniske rum, enten indsamling af hele leverprøver på flere tidssteder under en undersøgelse eller biopsi af leveren er nødvendig for histologisk analyse for at vurdere sygdomsstadiet.
Gennemførelse af en leverbiopsi midt i undersøgelsen er en invasiv og arbejdskrævende procedure, og indsamling af leverprøver til at vurdere sygdomsniveauet øger antallet af forskningsdyr, der er nødvendige for en undersøgelse. Der er således behov for en pålidelig, oversættelig, ikke-invasiv billedbiomarkør til at opdage NASH / NAFLD i disse prækliniske modeller. Ikke-invasive ultralyd-baserede B-mode billeder og Shear Wave Elastography (SWE) kan bruges til at måle steatose samt leverfibrose. For at vurdere nytten af SWE i prækliniske gnavermodeller af NASH blev dyr placeret på en pro-NASH-diæt og gennemgik ikke-invasiv ultralyd B-tilstand og forskydningsbølge elastografibilleddannelse for at måle hepatorenal (HR) indeks og leverelasticitet, der målte progressionen af henholdsvis akkumulering af leverfedt og vævsstivhed på flere tidspunkter i løbet af en given NAFLD / NASH-undersøgelse.
HR-indekset og elasticitetstallene blev sammenlignet med histologiske markører for steatose og fibrose. Resultaterne viste stærk sammenhæng mellem HR-indekset og procentdelen af olierød O (ORO) farvning, samt mellem elasticitet og Picro-Sirius Red (PSR) farvning af lever. Den stærke sammenhæng mellem klassiske ex vivo-metoder og in vivobilleddannelsesresultater giver bevis for, at forskydningsbølgeelastografi/ultralydsbaseret billeddannelse kan bruges til at vurdere sygdomsfænotype og progression i en præklinisk model af NAFLD/NASH.
Introduction
Ikke-alkoholisk fedtlever sygdom (NAFLD) er en metabolisk tilstand karakteriseret ved en overdreven ophobning af fedt i leveren og er hurtigt ved at blive en førende lever lidelse på verdensplan med en nyligt rapporteret global udbredelse på 25%1. Ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) er en mere udviklet fase af spektret af NAFLD, karakteriseret ved overskydende leverfedt med progressiv cellulær skade, betændelse, og fibrose. Disse lidelser er ofte tavse, uopdaget via blodprøver eller rutinemæssige undersøgelser, indtil der allerede er sket betydelig skade på en patients lever. I øjeblikket er guldstandarden til at diagnosticere NASH hos patienter gennem histologisk undersøgelse af patientafledte leverbiopsiprøver. Tilsvarende, prækliniske forskere, der arbejder for at forstå patogenesen af NASH / NAFLD samt lægemiddeludvikling industrien er afhængige af in vivo kile biopsi af leverprøver eller terminal aktiv dødshjælp af satellit kohorter til histologi til måling steatose, betændelse, og fibrose.
For eksempel har lever kilebiopsi været en standardteknik til vurdering af steatohepatitis og fibrose, mens du bruger GUBRA NASH-model2. Leverkilebiopsimetoden er invasiv og besværlig hos små dyr3. Brugen af kileleverbiopsi midt i en undersøgelse repræsenterer en ekstra eksperimentel variabel i en sygdomsmodel, hvilket ofte øger antallet af dyr, der er nødvendige. Med disse faktorer i tankerne, ikke-invasive billeddannelse teknikker, der kan bruges til pålideligt at vurdere steatose og fibrose i NASH / NAFLD dyremodeller på tidlige tidspunkter viser sig værdifulde. Shear bølge elastografi (SWE) er en ultralyd-baseret metode, der anvendes til at måle elasticiteten af blødt væv. Teknikken måler udbredelsen af forskydningsbølger skabt af supersoniske ultralydsimpulser rettet mod et vævsmål og beregner derefter en værdi kaldet E modulus4. Hastigheden af forskydningsbølgen er proportional med graden af vævsstivhed.
Figur 1 og figur 2 viser opsætningen af billedbehandlingsområdet og SWE-instrumentet. SWE-instrumentet er en enkelt, hjulet enhed med to skærme og et kontrolpanel vist i figur 2A. Den øverste skærm (Figur 2B) fungerer som computerskærm og viser billeder og patientmapper. Kontrolpanelet (Figur 2C) er en række knapper og ringer, der styrer generelle aspekter af billedoptagelse: frysning af skærm, lagring af billeder, skift fra en tilstand til en anden. Den nederste skærm (Figur 2D) er en berøringsskærm med ekstra kontrolelementer til at ændre indstillinger og fungerer som et tastatur til at indtaste data efter behov. Instrumentet er udstyret med en pen til brug på berøringsskærmen, hvis det ønskes. Ultralydsonder fastgøres til enhedens nederste frontpanel. Til B-tilstand og SWE-billeddannelse hos gnavere blev den superline lineære 6 til 20 MHz transducer brugt. Denne evne til ikke-invasivt at måle vævsstivhed gør SWE til et værdifuldt værktøj til identifikation og iscenesættelse af leverfibrose5 hos NASH-patienter, hvilket reducerer behovet for mere invasive metoder. SWE er faktisk blevet brugt til at måle leverfibrose hos patienter og er en FDA-godkendt metode til at score fibrose i klinikken6. Brug af SWE til at overvåge NASH progression i dyremodeller af sygdommen ville give et translationelt værktøj til udvikling af behandlinger og samtidig forbedre dyrevelfærden gennem reduktion af antallet af dyr og raffinement af in vivo procedurer for at minimere smerte og angst.
SWE-billeddannelse hos humane patienter bruger en lavfrekvent ultralydstransducer4, som ikke er ideel til små dyr. Især er højfrekvente SWE-teknikker blevet anvendt til at evaluere effekten af acetyl-CoA carboxylase hæmning på patogenese af NASH i en rotte model7, og nytten af denne teknik er blevet beskrevet i carbon tetrachlorid rotte modeller af leverfibrose med vellykkede resultater sammenlignet med traditionelle METAVIR histologiske scoringsmetoder8. Eksisterende litteratur mangler imidlertid detaljerede teknik- og metodeoplysninger om anvendelsen af SWE-billeddannelse i prækliniske modeller af NASH. Som beskrevet ovenfor, lever steatose er en af de vigtigste elementer i NAFLD/NASH tilstand og er et vigtigt stadium, hvor intervention kan overvejes. Således, vurdering af leverfedt ophobning ved hjælp af en billeddannelse modalitet er lige så vigtigt som at vurdere leverfibrose i prækliniske modeller af NASH/NAFLD.
En ultralydsteknik kendt som HR-indekset, et forhold mellem leverens lysstyrke i vævet i forhold til nyrebarkens, er blevet brugt som surrogatmarkør for steatose i klinikken9,10. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke blevet anvendt i vid udstrækning i prækliniske dyremodeller af NAFLD/NASH. Denne artikel beskriver en metode til måling af elasticitet samt HR-indekset som en surrogatmarkør for hepatisk fibrose og steatose, henholdsvis i en cholin-mangelfuld, fedtrig kost (CDAHFD) rotte model af NAFLD / NASH. Denne model fremkalder hurtig steatose, leverbetændelse og fibrose, som er målbar inden for 6 uger hos mus11. Tilsætning af kolesterol (1%) til denne diæt har vist sig at fremme fibrogenese hos rotter12, hvilket gør denne model en egnet kandidat til valideringsundersøgelser, der involverer forskydningsbølgebilleddannelse. Samlet set kan denne billedbehandlingsteknologi også anvendes på en bred vifte af NASH-modeller / diæter, hvor steatose og / eller fibrose er et endepunkt af interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ultralydsbaseret billeddannelse, herunder SWE, kan være et uvurderligt værktøj til langsgående vurdering af lever steatose og stivhed i prækliniske modeller af NAFLD / NASH. Dette papir beskriver detaljerede metoder til, hvordan man erhverver B-tilstand af høj kvalitet samt SWE-billeder af lever til måling af HR-indekset og elasticitet ved hjælp af en CDAHFD-diætinduceret rottemodel af NASH. Endvidere viser resultaterne fremragende korrelation mellem HR-indekset og elasticitet med guldstandarden for evaluerings-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Pfizer Comparative Medicine Operations Team for deres hårde arbejde med at passe og sikre studiedyrenes sundhed samt hjælpe med nogle af teknikkerne. Også, tak er skyldige til Danielle Crowell, Gary Seitis, og Jennifer Ashley Olson for deres hjælp med vævsbehandling for histologiske analyser. Derudover vil forfatterne gerne takke Julita Ramirez for at gennemgå og give værdifuld feedback under udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1 (2018).
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
