Этот протокол описывает использование расширенной ультразвуковой техники для неинвазивного наблюдения и количественной оценки изменений ткани печени в моделях грызунов с неалкогольной жировой болезнью печени.
Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является состоянием в спектре неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая характеризуется накоплением жира в печени (стеатоз) и воспалением, приводящим к фиброзу. Доклинические модели, близко переименовывающие НАСГ/НАЖБП человека, имеют важное значение для разработки лекарств. В то время как биопсия печени в настоящее время является золотым стандартом для измерения прогрессирования и диагностики НАЖБП / НАСГ в клинике, в доклиническом пространстве для гистологического анализа для оценки стадии заболевания необходим либо сбор целых образцов печени в нескольких временных точках во время исследования, либо биопсия печени.
Проведение биопсии печени в середине исследования является инвазивной и трудоемкой процедурой, а сбор образцов печени для оценки уровня заболевания увеличивает количество исследовательских животных, необходимых для исследования. Таким образом, существует потребность в надежном, переводимом, неинвазивном биомаркере визуализации для обнаружения НАСГ/НАЖБД в этих доклинических моделях. Неинвазивные ультразвуковые изображения B-режима и эластография сдвиговых волн (SWE) могут использоваться для измерения стеатоза, а также фиброза печени. Чтобы оценить полезность SWE в доклинических моделях НАСГ для грызунов, животных поместили на диету с про-НАСГ и подвергли неинвазивной ультразвуковой визуализации B-мод и эластографии сдвиговых волн для измерения гепаторенального (ЧСС) индекса и эластичности печени, измеряя прогрессирование как накопления жира в печени, так и жесткости тканей, соответственно, в нескольких временных точках в течение данного исследования НАЖБП / НАСГ.
Индекс ЧС и показатели эластичности сравнивали с гистологическими маркерами стеатоза и фиброза. Результаты показали сильную корреляцию между индексом HR и процентом окрашивания Oil Red O (ORO), а также между эластичностью и окрашиванием печени Picro-Sirius Red (PSR). Сильная корреляция между классическими методами ex vivo и результатами визуализации in vivo свидетельствует о том, что эластография сдвиговых волн / ультразвуковая визуализация могут быть использованы для оценки фенотипа и прогрессирования заболевания в доклинической модели НАЖБП/НАСГ.
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является метаболическим состоянием, характеризующимся чрезмерным накоплением жира в печени, и быстро становится ведущим заболеванием печени во всем мире с недавно зарегистрированной глобальной распространенностью 25%1. Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является более прогрессирующей стадией спектра НАЖБП, характеризующейся избытком жира печени с прогрессирующим повреждением клеток, воспалением и фиброзом. Эти недуги часто молчат, не обнаруживаются с помощью анализов крови или обычных осмотров, пока не произошло значительное повреждение печени пациента. В настоящее время золотым стандартом для диагностики НАСГ у пациентов является гистологическое исследование образцов биопсии печени, полученных пациентом. Аналогичным образом, доклинические исследователи, которые работают над пониманием патогенеза НАСГ / НАЖБП, а также индустрии разработки лекарств, полагаются на биопсию клина in vivo образцов печени или терминальную эвтаназию спутниковых когорт для гистологии для измерения стеатоза, воспаления и фиброза.
Например, клиновидная биопсия печени была стандартным методом оценки стеатогепатита и фиброза при использовании модели GUBRA NASH2. Метод клиновидной биопсии печени является инвазивным и трудоемким у мелких животных3. Использование клиновидной биопсии печени в середине исследования представляет собой дополнительную экспериментальную переменную в модели заболевания, которая часто увеличивает количество необходимых животных. Учитывая эти факторы, неинвазивные методы визуализации, которые могут быть использованы для надежной оценки стеатоза и фиброза в животных моделях НАСГ / НАЖБВ в ранние моменты времени, оказываются ценными. Эластография сдвиговых волн (SWE) – это ультразвуковой метод, используемый для измерения эластичности мягких тканей. Метод измеряет распространение волн сдвига, создаваемых сверхзвуковыми ультразвуковыми импульсами, направленными на тканевую мишень, а затем вычисляет значение, называемое модулем E4. Скорость волны сдвига пропорциональна степени жесткости тканей.
На рисунках 1 и 2 показана настройка области визуализации и прибор SWE. Прибор SWE представляет собой один колесный блок с двумя экранами и панелью управления, показанный на рисунке 2A. Верхний монитор(рисунок 2B)действует как монитор компьютера и отображает изображения и каталоги пациентов. Панель управления(рисунок 2C)представляет собой массив кнопок и циферблатов, которые управляют общими аспектами захвата изображения: замораживание экрана, сохранение изображений, переход из одного режима в другой. Нижний экран(рисунок 2D)представляет собой сенсорный экран с дополнительными элементами управления для изменения настроек и действует как клавиатура для ввода данных по мере необходимости. Прибор оснащен стилусом для использования на сенсорном экране при желании. Ультразвуковые зонды крепятся к нижней передней панели прибора. Для визуализации B-режима и SWE у грызунов использовался суперлинейный преобразователь от 6 до 20 МГц. Эта способность неинвазивно измерять жесткость тканей делает SWE ценным инструментом для идентификации и постановки фиброза печени5 у пациентов с НАСГ, уменьшая потребность в более инвазивных методах. SWE, фактически, использовался для измерения фиброза печени у пациентов и является одобренным FDA методом оценки фиброза в клинике6. Использование SWE для мониторинга прогрессирования НАСГ на животных моделях заболевания обеспечит трансляционный инструмент для разработки методов лечения и одновременно улучшит благополучие животных за счет сокращения числа животных и совершенствования процедур in vivo для минимизации боли и дистресса.
SWE-визуализация у пациентов с человеческим контролем использует низкочастотный ультразвуковой преобразователь4,который не идеален для мелких животных. Примечательно, что высокочастотные методы SWE были использованы для оценки эффективности ингибирования ацетил-КоА-карбоксилазы на патогенез НАСГ в модели7крыс, и полезность этого метода была описана в тетрахлорметановых крысах, моделях фиброза печени с успешными результатами по сравнению с традиционными методами гистологической оценки METAVIR8. Однако в существующей литературе отсутствует подробная информация о технике и методологии применения визуализации SWE в доклинических моделях НАСГ. Как описано выше, стеатоз печени является одной из ключевых особенностей состояния НАЖБВ/НАСГ и является важным этапом, на котором может быть рассмотрено вмешательство. Таким образом, оценка накопления жира в печени с использованием метода визуализации так же важна, как и оценка фиброза печени в доклинических моделях НАСГ/НАЖБП.
Ультразвуковой метод, известный как индекс ЧС, соотношение яркости тканей печени по сравнению с почечной корой, был использован в качестве суррогатного маркера стеатоза в клинике9,10. Этот подход, однако, не был широко использован в доклинических животных моделях НАЖБЛ/НАСГ. В этой статье описывается метод измерения эластичности, а также индекса ЧСС в качестве суррогатного маркера фиброза и стеатоза печеночной области, соответственно, в модели крыс с дефицитом холина и высоким содержанием жиров (CDAHFD) НАЖБП/НАСГ. Эта модель вызывает быстрый стеатоз, воспаление печени и фиброз, который можно измерить в течение 6 недель у мышей11. Было показано, что добавление холестерина (1%) к этой диете способствует фиброгенезу у крыс12,что делает эту модель подходящим кандидатом для валидационных исследований, включающих визуализацию сдвиговых волн. В целом, эта технология визуализации также может быть применена к широкому спектру моделей / диет НАСГ, где стеатоз и / или фиброз являются конечной точкой интереса.
Ультразвуковая визуализация, включая SWE, может быть бесценным инструментом для продольной оценки стеатоза печени и жесткости в доклинических моделях НАЖБВ/НАСГ. В этой статье описываются подробные методологии получения высококачественного B-режима, а также SWE-изображений печени для и?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить команду Pfizer Comparative Medicine Operations Team за их тяжелую работу по управляющей и обеспечивающей здоровье исследуемых животных, а также за помощь с некоторыми методами. Кроме того, спасибо Даниэль Кроуэлл, Гэри Сейтису и Дженнифер Эшли Олсон за их помощь в обработке тканей для гистологического анализа. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Джулиту Рамирес за рецензирование и предоставление ценных отзывов во время подготовки этой рукописи.
Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
Alpha-dri bedding | rat cages | ||
Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
Purina | 5053 | Control animal chow | |
Wistar Han rats | Charles River Laboratories |