Toepassing van echografie en shear wave elastografie beeldvorming in een rat model van NAFLD / NASH
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een verbeterde ultrasone techniek om niet-invasief leverweefselveranderingen te observeren en te kwantificeren in knaagdiermodellen van niet-alcoholische leververvetting.
Abstract
Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is een aandoening binnen het spectrum van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), die wordt gekenmerkt door ophoping van levervet (steatose) en ontsteking die leidt tot fibrose. Preklinische modellen die menselijke NASH/NAFLD nauw samenvatten, zijn essentieel bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Hoewel leverbiopsie momenteel de gouden standaard is voor het meten van NAFLD / NASH-progressie en diagnose in de kliniek, is in de preklinische ruimte ofwel verzameling van hele levermonsters op meerdere tijdstippen tijdens een studie of biopsie van de lever nodig voor histologische analyse om het ziektestadium te beoordelen.
Het uitvoeren van een leverbiopsie halverwege de studie is een invasieve en arbeidsintensieve procedure en het verzamelen van levermonsters om het ziekteniveau te beoordelen, verhoogt het aantal onderzoeksdieren dat nodig is voor een onderzoek. Er is dus behoefte aan een betrouwbare, vertaalbare, niet-invasieve beeldvormingsbiomarker om NASH / NAFLD in deze preklinische modellen te detecteren. Niet-invasieve echografie-gebaseerde B-modus beelden en Shear Wave Elastography (SWE) kunnen worden gebruikt om steatose en leverfibrose te meten. Om het nut van SWE in preklinische knaagdiermodellen van NASH te beoordelen, werden dieren op een pro-NASH-dieet geplaatst en ondergingen ze niet-invasieve ultrasone B-modus en shear wave elastografie beeldvorming om de hepatorenale (HR) index en leverelasticiteit te meten, waarbij de progressie van respectievelijk levervetaccumulatie en weefselstijfheid op meerdere tijdstippen in de loop van een bepaalde NAFLD / NASH-studie werd gemeten.
De HR-index en elasticiteitsgetallen werden vergeleken met histologische markers van steatose en fibrose. De resultaten toonden een sterke correlatie tussen de HR-index en het percentage Oil Red O (ORO) kleuring, evenals tussen elasticiteit en Picro-Sirius Red (PSR) kleuring van levers. De sterke correlatie tussen klassieke ex vivo methoden en in vivo beeldvormingsresultaten levert bewijs dat shear wave elastografie/echografie-gebaseerde beeldvorming kan worden gebruikt om het fenotype en de progressie van de ziekte te beoordelen in een preklinisch model van NAFLD/NASH.
Introduction
Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een metabole aandoening die wordt gekenmerkt door een overmatige opeenhoping van vet in de lever en wordt snel een toonaangevende leveraandoening wereldwijd met een onlangs gerapporteerde wereldwijde prevalentie van 25%1. Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is een meer gevorderd stadium van het spectrum van NAFLD, gekenmerkt door overtollig levervet met progressieve cellulaire schade, ontsteking en fibrose. Deze aandoeningen zijn vaak stil, onopgemerkt via bloedonderzoek of routineonderzoeken, totdat er al aanzienlijke schade is opgetreden aan de lever van een patiënt. Momenteel is de gouden standaard om NASH bij patiënten te diagnosticeren door histologisch onderzoek van van de patiënt afgeleide leverbiopsiemonsters. Evenzo vertrouwen preklinische onderzoekers die werken aan het begrijpen van de pathogenese van NASH / NAFLD en de geneesmiddelenontwikkelingsindustrie op in vivo wigbiopsie van levermonsters of terminale euthanasie van satellietcohorten voor histologie om steatose, ontsteking en fibrose te meten.
Leverwigbiopsie is bijvoorbeeld een standaardtechniek voor het beoordelen van steatohepatitis en fibrose tijdens het gebruik van het GUBRA NASH-model2. De leverwigbiopsiemethode is invasief en arbeidsintensief bij kleine dieren3. Het gebruik van wigleverbiopsie in het midden van een studie vertegenwoordigt een toegevoegde experimentele variabele in een ziektemodel, waardoor het aantal dieren dat nodig is vaak toeneemt. Met deze factoren in gedachten blijken niet-invasieve beeldvormingstechnieken die kunnen worden gebruikt om steatose en fibrose in NASH / NAFLD-diermodellen op vroege tijdstippen betrouwbaar te beoordelen, waardevol. Shear wave elastography (SWE) is een op echografie gebaseerde methode die wordt gebruikt om de elasticiteit van zachte weefsels te meten. De techniek meet de voortplanting van schuifgolven gecreëerd door supersonische ultrasone pulsen gericht op een weefseldoel en berekent vervolgens een waarde genaamd E modulus4. De snelheid van de schuifgolf is evenredig met de mate van weefselstijfheid.
Figuur 1 en figuur 2 tonen de opstelling van het beeldvormingsgebied en het SWE-instrument. Het SWE-instrument is een enkele eenheid op wielen met twee schermen en een bedieningspaneel in figuur 2A. De bovenste monitor(figuur 2B)fungeert als de computermonitor en geeft beelden en patiëntmappen weer. Hetbedieningspaneel (Figuur 2C)is een reeks knoppen en draaiknoppen die algemene aspecten van het vastleggen van afbeeldingen regelen: het bevriezen van het scherm, het opslaan van afbeeldingen, het overschakelen van de ene modus naar de andere. Het onderste scherm(Figuur 2D)is een aanraakscherm met extra bedieningselementen om instellingen te wijzigen en fungeert als een toetsenbord om gegevens in te voeren als dat nodig is. Het instrument is uitgerust met een stylus om desgewenst op het touchscreen te gebruiken. Ultrasone sondes worden bevestigd aan het onderste voorpaneel van het apparaat. Voor B-mode en SWE beeldvorming bij knaagdieren werd de super-lineaire 6 tot 20 MHz transducer gebruikt. Dit vermogen om weefselstijfheid niet-invasief te meten, maakt SWE een waardevol hulpmiddel voor de identificatie en stadiëring van leverfibrose5 bij NASH-patiënten, waardoor de behoefte aan meer invasieve methoden afneemt. SWE is in feite gebruikt om leverfibrose bij patiënten te meten en is een door de FDA goedgekeurde methode om fibrose in de kliniek te scoren6. Het gebruik van SWE om de NASH-progressie in diermodellen van de ziekte te volgen, zou een translationeel hulpmiddel zijn voor de ontwikkeling van behandelingen en tegelijkertijd het dierenwelzijn verbeteren door de vermindering van het aantal proefpersonen en verfijning van in vivo procedures om pijn en angst te minimaliseren.
SWE-beeldvorming bij menselijke patiënten maakt gebruik van een laagfrequente ultrasone transducer4, wat niet ideaal is voor kleine dieren. Met name zijn hoogfrequente SWE-technieken gebruikt om de werkzaamheid van acetyl-CoA carboxylase remming op pathogenese van NASH in een rat model7te evalueren , en het nut van deze techniek is beschreven in koolstoftetrachloride rat modellen van leverfibrose met succesvolle resultaten in vergelijking met traditionele METAVIR histologische scoringsmethoden8. In de bestaande literatuur ontbreekt het echter aan gedetailleerde technische en methodologische informatie over de toepassing van SWE-beeldvorming in preklinische modellen van NASH. Zoals hierboven beschreven, is leversteatose een van de belangrijkste kenmerken van de NAFLD / NASH-aandoening en is het een belangrijke fase waarin interventie kan worden overwogen. Het beoordelen van de accumulatie van levervet met behulp van een beeldvormingsmodaliteit is dus net zo belangrijk als het beoordelen van leverfibrose in preklinische modellen van NASH / NAFLD.
Een ultrasone techniek die bekend staat als de HR-index, een verhouding van weefselhelderheid van de lever in vergelijking met die van de nierschors, is gebruikt als een surrogaatmarker van steatose in de kliniek9,10. Deze benadering is echter niet op grote schaal gebruikt in preklinische diermodellen van NAFLD / NASH. Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van elasticiteit en de HR-index als een surrogaatmarker van respectievelijk leverfibrose en steatose in een choline-deficiënt, vetrijk dieet (CDAHFD) rattenmodel van NAFLD / NASH. Dit model induceert snelle steatose, leverontsteking en fibrose, die meetbaar is binnen 6 weken bij muizen11. Het is aangetoond dat de toevoeging van cholesterol (1%) aan dit dieet fibrogenese bij rattenbevordert 12, waardoor dit model een geschikte kandidaat is voor validatiestudies met afschuifgolfbeeldvorming. Over het algemeen kan deze beeldvormingstechnologie ook worden toegepast op een breed scala aan NASH-modellen / diëten waar steatose en / of fibrose een eindpunt van belang is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Echografie-gebaseerde beeldvorming, waaronder SWE, kan een waardevol hulpmiddel zijn voor de longitudinale beoordeling van leversteatose en stijfheid in preklinische modellen van NAFLD / NASH. Dit artikel beschrijft gedetailleerde methodologieën voor het verkrijgen van hoogwaardige B-modus en SWE-afbeeldingen van levers voor het meten van de HR-index en elasticiteit met behulp van een CDAHFD-dieet-geïnduceerd rattenmodel van NASH. Verder tonen de resultaten een uitstekende correlatie van de HR-index en elasticiteit met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het Pfizer Comparative Medicine Operations Team bedanken voor hun harde werk om de gezondheid van de onderzoeksdieren te verzorgen en te waarborgen en om te helpen met enkele van de technieken. Ook zijn dank verschuldigd aan Danielle Crowell, Gary Seitis en Jennifer Ashley Olson voor hun hulp bij weefselverwerking voor histologische analyses. Daarnaast willen de auteurs Julita Ramirez bedanken voor het beoordelen en geven van waardevolle feedback tijdens de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1 (2018).
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
