קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין
Summary
אנו מתארים את השיטה לניתוח כמותי של ההתפלגות של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה (3 מיקרומטר בגודל) דרכי הנשימה של עכברים. השיטה יכולה לשמש גם לניתוח של חלקיקים מיקרו חלקיקים וחלוקת ננו-חלקיקים בדרכי הנשימה במודלים שונים של מצב פתולוגי.
Abstract
אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה הם פתוגנים מוטסים שיכולים לחדור דרכי הנשימה האנושיות. אנשים אימונו-מוכשרים ללא אלרגיות מפגינים עמידות וסובלנות חיסונית, ואילו בחולים אימונו-קום, קונידיה יכולה ליישב דרכי הנשימה ולגרום להפרעות נשימה פולשניות חמורות. תאים שונים בתאי דרכי הנשימה השונים מעורבים בתגובה החיסונית המונעת פלישה פטרייתית; עם זאת, ההיבטים המרחבי-זמניים של חיסול פתוגן עדיין לא מובנים לחלוטין. הדמיה תלת ממדית (3D) של איברים בעלי הרכבה מלאה שנוקתה אופטית, במיוחד הריאות של עכברים ניסיוניים, מאפשרת זיהוי של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. במחקר הנוכחי, אנו מתארים התקנה ניסיונית לביצוע ניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM), איתרנו את המיקום של קונידיה שכותרתו פלואורסצנטית בענפי הסימפונות ובתא המכתשי 6 שעות לאחר יישום oropharyngeal לעכברים. הגישה המתוארת כאן שימשה בעבר לזיהוי מיקום הפתוגן המדויק וזיהוי התאים האינטראקטיביים של הפתוגן בשלבים שונים של התגובה החיסונית. ההתקנה הניסיונית יכולה לשמש להערכת הקינטיקה של חיסול הפתוגן בתנאים פתולוגיים שונים.
Introduction
על בסיס יומי, אנשים שואפים פתוגנים מוטסים, כולל נבגים של פטריות אופורטוניסטיות אספרגילוס פומיגאטוס (A. fumigatus conidia) שיכולים לחדור את דרכיהנשימה 1. דרכי הנשימה של היונקים היא מערכת של דרכי הנשימה של דורות שונים המאופיינים במבנים השונים של קירות דרכיהנשימה 2,3,4. קירות קנה הנשימה מורכבים ממספר סוגי תאים ביניהם תאים ססיליים המספקים את הסיווג הרירי5. ב alveoli, אין תאים ciliated ואת פתוגנים בחלל המצף חודר לא ניתן לחסל על ידי אישור רירית6. יתר על כן, כל ייצור דרכי הנשימה הוא נישה עבור אוכלוסיות תאי חיסון מרובות ותת קבוצות של אוכלוסיות אלה ייחודיות לתאי דרכי הנשימה מסוימים. לפיכך, מקרופאגים מכתשיים שוכנים בתאים מכתשיים, בעוד הן קנה הנשימה והן דרכי הנשימה המוליכות מרופדים בתאים דנדריטיים תוך-אפיטליים7,8.
הגודל המשוער של קונידיה A. fumigatus הוא 2-3.5 מיקרומטר9. מאז הקוטר של דרכי הנשימה הקטנות בבני אדם ואפילו בעכברים עולה על 3.5 מיקרומטר, הוצע כי conidia יכול לחדור את החלל המהשתי2,10,11. למעשה, בדיקה היסתולוגית הראתה את הצמיחה הפטרייתית ב alveoli של החולים הסובלים אספרגילוזיס12. Conidia זוהו גם alveoli של עכברים נגועים באמצעות הדמיה חיה של פרוסות הריאה העבה13. בו זמנית, conidia זוהו בצד הזוהר של אפיתל הסימפונות של עכברים14.
הדמיה תלת מימדית (3D) של ריאות העכבר המלא שנוקתה אופטית מאפשרת ניתוח מורפומטרי של דרכיהנשימה 15. במיוחד, הניתוח הכמותי של התפלגות עצב pleural הקרביים בוצע באמצעות אופטית ניקה דגימות ריאות עכבר15. לאחרונה, Amich ואח‘ 16 חקר את הצמיחה הפטרייתית לאחר יישום תוך נאוי של conidia לעכברים immunocompromised באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של דגימות ריאות עכבר נקי אופטית. המיקום המדויק של conidia המנוחה בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר הזיהום חשוב לזיהוי אוכלוסיות התאים שיכולים לספק הגנה אנטי פטרייתית מספקת בשלבים מסוימים של דלקת. עם זאת, בשל הגודל הקטן יחסית, ההיבטים המרחבי-זמניים של התפלגות קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה מאופיינים בצורה גרועה.
כאן, אנו מציגים מערך ניסיוני לניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה של עכברים נגועים. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM) של ריאות מנוקות אופטית של עכברים שקיבלו יישום oropharyngeal של conidia A. fumigatus, אנו מקבלים תמונות תלת-ממדיות ומבצעים את עיבוד התמונה. באמצעות הדמיה תלת-ממדית של אונת הריאות כולה, הראינו בעבר את ההתפלגות של קונידיה A. fumigatus בנתיב האוויר של עכברים 72 שעות לאחר יישום conidia8.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם מאפשרת קבלת הנתונים ללא ניתוח של הדגימה, שהיא בעלת חשיבות רבה לחקירת ההיבטים המרחביים של ההתפלגות האנטומית של הפתוגן באורגניזם. ישנן מספר טכניקות ושינויים של ניקוי אופטי רקמה המסייעים להתגבר על פיזור אור הלייזר ולאפשר הדמיה של איברים שלמים15,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לפרופ’ סוון קרפמן (בית החולים האוניברסיטאי ארלנגן ו-FUA ארלנגן-נורנברג, גרמניה) על אספקת זן הקונידיה אספרגילוס פומיגטוס AfS150. המחברים מודים למשרד העיתונות MIPT. V.B. מכיר משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (#075-00337-20-03, פרויקט FSMG-2020-0003). העבודה לגבי הדמיה וכימות של קונידיה A. fumigatus נתמכה על ידי RSF No 19-75-00082. העבודה לגבי הדמיית דרכי הנשימה נתמכה על ידי RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
