Confocale laserscanning microscopie-gebaseerde kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in whole-mount optisch gewiste muislong
Summary
We beschrijven de methode voor kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groot) in de luchtwegen van muizen. De methode kan ook worden gebruikt voor de analyse van microdeeltjes en nanodeeltjes agglomeraat distributie in de luchtwegen in verschillende pathologische conditiemodellen.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia zijn ziekteverwekkers in de lucht die menselijke luchtwegen kunnen binnendringen. Immunocompetente mensen zonder allergieën vertonen resistentie en immunologische tolerantie, terwijl bij immuungecompromitteerde patiënten conidia de luchtwegen kan koloniseren en ernstige invasieve ademhalingsstoornissen kan veroorzaken. Verschillende cellen in verschillende luchtwegcompartimenten zijn betrokken bij de immuunrespons die schimmelinvasie voorkomt; de spatio-temporele aspecten van pathogene eliminatie zijn echter nog steeds niet volledig begrepen. Driedimensionale (3D) beeldvorming van optisch gewiste organen van hele bergen, met name de longen van experimentele muizen, maakt detectie van fluorescerend gelabelde pathogenen in de luchtwegen mogelijk op verschillende tijdstippen na infectie. In deze studie beschrijven we een experimentele opstelling om een kwantitatieve analyse uit te voeren van A. fumigatus conidia distributie in de luchtwegen. Met behulp van fluorescerende confocale laserscanmicroscopie (CLSM) hebben we de locatie van fluorescerend gelabelde conidia in de bronchiale takken en het alveolaire compartiment 6 uur na orofaryngeale toepassing op muizen getraceerd. De hier beschreven aanpak werd eerder gebruikt voor de detectie van de precieze locatie van de ziekteverwekker en de identificatie van de pathogene interagerende cellen in verschillende fasen van de immuunrespons. De experimentele opstelling kan worden gebruikt om de kinetiek van de eliminatie van pathogenen in verschillende pathologische omstandigheden te schatten.
Introduction
Dagelijks inhaleren mensen ziekteverwekkers in de lucht, waaronder sporen van opportunistische schimmels Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) die de luchtwegen kunnen binnendringen1. De luchtwegen van zoogdieren is een systeem van luchtwegen van verschillende generaties die worden gekenmerkt door de verschillende structuren van de luchtwegwanden2,3,4. Tracheobronchiale wanden bestaan uit verschillende celtypen, waaronder ciliated cellen die de mucociliaire klaring bieden5. In de longblaasjes zijn er geen ciliated cellen en de doordringende alveolaire ruimtepathogenen kunnen niet worden geëlimineerd door de mucociliaire klaring6. Bovendien is elke luchtweggeneratie een niche voor meerdere immuuncelpopulaties en zijn subsets van deze populaties uniek voor bepaalde luchtwegcompartimenten. Alveolaire macrofagen bevinden zich dus in de alveolaire compartimenten, terwijl zowel de luchtpijp als de geleidende luchtwegen zijn bekleed met de intra-epitheliale dendritische cellen7,8.
De geschatte grootte van A. fumigatus conidia is 2-3,5 μm9. Aangezien de diameter van kleine luchtwegen bij mensen en zelfs bij muizen groter is dan 3,5 μm, werd gesuggereerd dat conidia de alveolaire ruimte kan binnendringen2,10,11. In feite toonde histologisch onderzoek de schimmelgroei in de longblaasjes van de patiënten die lijden aan aspergillose12. Conidia werden ook gedetecteerd in de longblaasjes van geïnfecteerde muizen met behulp van levende beeldvorming van de dikke longschijfjes13. Tegelijkertijd werden conidia gedetecteerd in de lichtgevende kant van het bronchiale epitheel van muizen14.
Driedimensionale (3D) beeldvorming van de optisch ontruimde muislongen met hele montering maakt morfometrische analyse van de luchtwegenmogelijk 15. In het bijzonder werd de kwantitatieve analyse van de viscerale pleurale zenuwverdeling uitgevoerd met behulp van optisch gewiste muislongmonsters15. Onlangs onderzochten Amich et al.16 de schimmelgroei na intranasale toepassing van conidia op de immuungecompromitteerde muizen met behulp van een lichtbladfluorescentiemicroscopie van optisch gewiste muizenlongmonsters. De precieze locatie van de rustende conidia in de luchtwegen op verschillende tijdstippen na de infectie is belangrijk voor het identificeren van de celpopulaties die voldoende antischimmelverdediging kunnen bieden in bepaalde fasen van ontsteking. Vanwege de relatief kleine omvang worden de spatio-temporele aspecten van A. fumigatus conidia-distributie in de luchtwegen echter slecht gekarakteriseerd.
Hier presenteren we een experimentele opstelling voor de kwantitatieve analyse van A. fumigatus conidia distributie in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen. Met behulp van fluorescerende confocale laserscanmicroscopie (CLSM) van optisch gewiste longen van muizen die een orofaryngeale toepassing van de fluorescerend gelabelde A. fumigatus conidia kregen, verkrijgen we 3D-beelden en voeren we de beeldverwerking uit. Met behulp van 3D-beeldvorming van de longkwab met de hele montering hebben we eerder de verdeling van A. fumigatus conidia in de geleidende luchtwegen van muizen 72 uur na conidia-toepassing8getoond .
Protocol
Representative Results
Discussion
3D-beeldvorming van het hele orgaan maakt het mogelijk om de gegevens te verkrijgen zonder dissectie van het specimen, wat van groot belang is voor het onderzoeken van de ruimtelijke aspecten van de anatomische verdeling van de ziekteverwekker in het organisme. Er zijn verschillende technieken en modificaties van weefsel optische clearing die helpen om de laser licht verstrooiing te overwinnen en maken hele-orgaan beeldvorming15,16,18…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken prof. Sven Krappmann (Universitair Ziekenhuis Erlangen en FUA Erlangen-Nürnberg, Duitsland) voor het leveren van de Aspergillus fumigatus conidia stam AfS150. De auteurs bedanken MIPT Press Office. V.B. erkent het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie (#075-00337-20-03, project FSMG-2020-0003). Het werk met betrekking tot A. fumigatus conidia imaging en quantification werd ondersteund door RSF nr. 19-75-00082. Het werk met betrekking tot beeldvorming van de luchtwegen werd ondersteund door RFBR nr. 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
