Análise quantitativa baseada em microscopia a laser confocal da distribuição de aspergillus fumigatus conidia em pulmão de rato totalmente limpo opticamente
Summary
Descrevemos o método de análise quantitativa da distribuição de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamanho) nas vias aéreas dos camundongos. O método também pode ser utilizado para a análise de micropartículas e distribuição de nanopartículas nas vias aéreas em vários modelos de condições patológicas.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia são patógenos aéreos que podem penetrar nas vias aéreas humanas. Pessoas imunocompetntes sem alergias apresentam resistência e tolerância imunológica, enquanto em pacientes imunocomprometidos, a conidia pode colonizar as vias aéreas e causar distúrbios respiratórios graves. Várias células em diferentes compartimentos das vias aéreas estão envolvidas na resposta imune que previne a invasão fúngica; no entanto, os aspectos espátulais-temporais da eliminação do patógeno ainda não são completamente compreendidos. Imagens tridimensionais (3D) de órgãos de montagem total eliminados opticamente, particularmente os pulmões de camundongos experimentais, permitem a detecção de patógenos fluorescentes rotulados nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção. No presente estudo, descrevemos uma configuração experimental para realizar uma análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM), rastreamos a localização de conidia fluorescente rotulada nos ramos brônquicos e no compartimento alveolar 6 horas após a aplicação do orofaringe aos ratos. A abordagem aqui descrita foi previamente utilizada para detecção da localização precisa do patógeno e identificação das células que interagem com patógenos em diferentes fases da resposta imune. A configuração experimental pode ser usada para estimar a cinética da eliminação do patógeno em diferentes condições patológicas.
Introduction
Diariamente, as pessoas inalam patógenos transmitidos pelo ar, incluindo esporos de fungos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que podem penetrar no trato respiratório1. O trato respiratório dos mamíferos é um sistema de vias aéreas de diferentes gerações que se caracterizam pelas diferentes estruturas das paredes das vias aéreas2,3,4. As paredes traqueobronquiais consistem em vários tipos de células entre as quais estão células ciliadas que fornecem o desembaraço mucociliar5. Nos alvéolos, não há células ciliadas e os patógenos espaciais alveolares penetrantes não podem ser eliminados pelo desembaraço mucociliary6. Além disso, cada geração de vias aéreas é um nicho para múltiplas populações de células imunes e subconjuntos dessas populações são únicos para certos compartimentos das vias aéreas. Assim, os macrófagos alveolares residem nos compartimentos alveolares, enquanto tanto a traqueia quanto as vias aéreas condutoras são forradas com as células dendríticas intraepitheliais7,8.
O tamanho aproximado de A. fumigatus conidia é de 2-3,5 μm9. Uma vez que o diâmetro das pequenas vias aéreas em humanos e até mesmo em camundongos excede 3,5 μm, foi sugerido que a conidia pode penetrar no espaço alveolar2,10,11. De fato, o exame histológico mostrou o crescimento fúngico nos alvéolos dos pacientes que sofrem de aspergillose12. Conidia também foi detectada nos alvéolos de camundongos infectados usando imagens vivas das fatias de pulmão espessas13. Simultaneamente, conidia foi detectada no lado luminal do epitélio brônquico dos camundongos14.
A imagem tridimensional (3D) dos pulmões do rato de montagem total eliminados opticamente permite a análise morfométrica das vias aéreas15. Particularmente, a análise quantitativa da distribuição visceral do nervo pleural foi realizada utilizando amostras de pulmão de camundongos adequadamente limpas15. Recentemente, Amich et al.16 investigaram o crescimento fúngico após a aplicação intranasal de conídio aos camundongos imunocomprometidos usando uma microscopia de fluorescência de folhas leves de amostras pulmonares de camundongos eliminados opticamente. A localização precisa da conidia de repouso nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção é importante para identificar as populações celulares que podem fornecer defesa antifúngica suficiente em determinadas fases de inflamação. No entanto, devido ao tamanho relativamente pequeno, os aspectos espástico-temporais da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas são mal caracterizados.
Aqui, apresentamos uma configuração experimental para a análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas de camundongos infectados. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM) de pulmões opticamente limpos de camundongos que receberam uma aplicação orofaríngea da A. fumigatus conidia fluorescente, obtemos imagens 3D e realizamos o processamento da imagem. Usando imagens 3D do lobo pulmonar de todo o monte, já mostramos anteriormente a distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas condutoras de camundongos 72 horas após a aplicação conidia8.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imagem 3D de órgãos inteiros permite a obtenção dos dados sem dissecção da amostra, o que é de grande importância para investigar os aspectos espaciais da distribuição anatômica do patógeno no organismo. Existem várias técnicas e modificações de limpeza óptica tecidual que ajudam a superar a dispersão da luz laser e permitem imagens de órgãos inteiros15,16,18,19. Uma das a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Prof. Sven Krappmann (Hospital Universitário Erlangen e FUA Erlangen-Nürnberg, Alemanha) por fornecer a cepa Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Os autores agradecem a Assessoria de Imprensa do MIPT. V.B. reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa (#075-00337-20-03, projeto FSMG-2020-0003). O trabalho relativo à A. fumigatus conidia e quantificação foi apoiado pela RSF nº 19-75-00082. O trabalho de imagem das vias aéreas foi apoiado pela RFBR nº 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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