全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析
Summary
マウスの気道における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア(3μmの大きさ)の分布の定量分析方法について述べた。この方法は、様々な病理状態モデルにおける気道中の微粒子およびナノ粒子凝集分布の分析にも使用することができる。
Abstract
アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディアは、ヒトの気道に侵入することができる空中病原体である。アレルギーのない免疫管轄者は抵抗性および免疫学的耐性を示し、免疫不全患者では、コニディアは気道を植民地化し、重度の侵襲性呼吸器疾患を引き起こす可能性がある。異なる気道コンパートメント内の様々な細胞は、真菌の侵入を防ぐ免疫応答に関与しています。しかし、病原体の排除の時空間的な側面はまだ完全には理解されていません。光学的にクリアされた全実装器官、特に実験用マウスの肺の3次元(3D)画像化により、感染後の異なる時点で気道中の蛍光標識病原体を検出することができます。本研究では、気道における A.フミガトゥス コニジア分布の定量分析を行う実験セットアップについて説明する。蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、マウスへの中咽頭適用から6時間後に気管支枝および肺胞コンパートメントにおける蛍光標識されたコニディアの位置を追跡した。ここで説明するアプローチは、免疫応答の異なる段階での病原体の正確な位置の検出および病原体相互作用細胞の同定に以前に使用された。実験のセットアップは、異なる病理条件における病原体の除去の運動を推定するために使用することができる。
Introduction
日常的に、人々は、気道1に浸透し得る日和見真菌アスペルギルス・フミガトゥス(A.フミガトゥス・コニディア)の胞子を含む空中病原体を吸入する。哺乳類の気道は、気道壁2、3、4の異なる構造によって特徴付けられる異なる世代の気道のシステムである。気管気管支壁は、粘液性クリアランス5を提供する毛状細胞である複数の細胞タイプから構成されている。肺胞では、毛様体細胞がなく、粘膜クリアランス6では浸透性肺胞空間病原体を排除できない。さらに、各気道生成は複数の免疫細胞集団のニッチであり、これらの集団のサブセットは特定の気道コンパートメントにとってユニークである。したがって、肺胞マクロファージは肺胞室に存在し、気管と伝導気道の両方が上皮内樹状細胞7,8と並んでいる。
A.フミガトゥスコニディアの概算サイズは2-3.5 μm9.ヒトやマウスでも小さな気道の直径が3.5μmを超えるため、ジニディアが歯槽空間2、10、11を貫通できることが示唆された。実際、組織学的検査は、アスペルギルス症12に罹患している患者の胞皮の真菌の成長を示した。コニディアは、厚い肺スライス13のライブイメージングを用いて感染したマウスの肺胞でも検出された。同時に、マウス14の気管支上皮の光側でコニディアが検出された。
光学的にクリアされた全マウントマウス肺の3次元(3D)画像化は、気道15の形態学的分析を可能にする。特に、内臓胸膜神経分布の定量分析は、光学的にクリアされたマウス肺検体15を用いて行った。最近、Amich et16 は、光学的にクリアされたマウス肺検体の光シート蛍光顕微鏡を用いて、免疫不全マウスへの鼻腔内の経鼻適用後の真菌増殖を調査した。感染後の異なる時点で気道中の静止したコニディアの正確な位置は、炎症の特定の段階で十分な抗真菌防御を提供することができる細胞集団を同定するために重要である。しかし、比較的小さいサイズのため、気道における A.フミガトゥス ・コニディア分布の時空間的側面は十分に特徴付けが悪い。
ここでは、感染したマウスの気道におけるA.フミガトゥスコニジア分布の定量分析のための実験セットアップを提示する。蛍光標識A.フミガトゥス・コニディアの中咽頭適用を受けたマウスの光学的にクリアされた肺の蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、3D画像を取得し、画像処理を行う。全体実装肺葉の3D画像化を用いて、我々は、コニディア塗布8の72時間後にマウスの導電気道におけるA.フミガトゥス・コニディアの分布を示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
全臓器3Dイメージングは、標本の解剖なしでデータを取得することを可能にし、これは、生物における病原体の解剖学的分布の空間的側面を調査する上で非常に重要である。レーザー光散乱を克服し、全臓器イメージング15、16、18、19を可能にする組織光学クリアリングのいくつかの技術と修正があります。<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、スヴェン・クラップマン教授(ドイツの大学病院エアランゲンとFUAエルランゲン・ニュルンベルク)が アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア株AfS150を提供してくれたことに感謝する。著者らはMIPTプレスオフィスに感謝します。V.Bロシア連邦の科学と高等教育省を認める(#075-00337-20-03、プロジェクトFSMG-2020-0003)。 A.フミガトゥス コニディアイメージングと定量に関する研究は、RSF No 19-75-00082によってサポートされました。気道のイメージ投射に関する仕事はRFBR No 20-04-60311によって支えられた。
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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