전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석
Summary
우리는 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 (크기 3 μm)의 분포의 정량적 분석을위한 방법을 설명합니다. 또한 이 방법은 다양한 병리학적 상태 모델에서 기도내의 미세입자 및 나노입자 응집 분포의 분석에 사용될 수 있다.
Abstract
아스퍼 질러스 fumigatus 코니디아는 인간의 기도를 관통 할 수있는 공중 병원체입니다. 알레르기가없는 면역 능력이있는 사람들은 저항력과 면역 학적 내성을 나타내며 면역 손상 환자에서는 conidia가 기도를 식민지화하고 심각한 침습적 호흡기 질환을 일으킬 수 있습니다. 다른 기도 구획에 있는 각종 세포는 곰팡이 침략을 방지하는 면역 반응에서 관련시킵니다; 그러나 병원체 제거의 현세안-측두형 측면은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 광학적으로 클리어된 전산 기관, 특히 실험용 마우스의 폐의 3차원(3D) 이미징은 감염 후 다른 시점에서 기도에 형광으로 표지된 병원균의 검출을 허용합니다. 본 연구에서는, 우리는 기도에서 A. fumigatus conidia 분포의 정량적 분석을 수행하기 위한 실험 적인 설정을 기술합니다. 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용하여, 우리는 기관지 가지에 형광 표지 코니디아의 위치를 추적하고 폐포 구획 6 마우스에 구비 후 시간. 여기서 설명된 접근법은 면역 반응의 상이한 단계에서 병원균 상호 작용 세포의 정확한 병원체 위치 및 식별의 검출을 위해 이전에 사용되었습니다. 실험 설정은 다른 병리학 적 조건에서 병원체 제거의 운동학을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
매일, 사람들은 호흡기1을관통할 수 있는 기회성 곰팡이 아스퍼질러스 훈가투스(A.fumigatus conidia)의 포자를 포함하여 공중 병원균을 흡입한다. 포유동물의 호흡기는 기도벽2,3,4의상이한 구조를 특징으로 하는 다양한 세대의 기도 시스템이다. 기관막 벽은 점액 통관5를제공하는 섬모 세포인 여러 세포 유형으로 구성된다. 폐포에서는, 점액 통관6에의해 제거될 수 없고 관통폐포 공간 병원체가 없는 ciliated 세포 및 관통폐공간 병원체가 없습니다. 더욱이, 각 기도 생성은 다중 면역 세포 인구를 위한 틈새 시장이고 이 인구의 하위 집합은 특정 기도 구획을 위해 유일합니다. 따라서, 폐포 대식세포는 폐포 구획에 상주하며, 기관및 전도기도는 모두 상피 수지상 세포7,8로줄지어 있다.
A. fumigatus 코니디아의 대략적인 크기는 2-3.5 μm9입니다. 인간과 마우스에서도 작은 기도의 직경이 3.5 μm을 초과하기 때문에, 코니아가 폐포 공간2,10,11을관통할 수 있다는 것이 제안되었다. 실제로, 조직학적 검사는 아스퍼질로증(12)으로 고통받는 환자의 폐포에서곰팡이 성장을 보였다. 코니디아는 또한 두꺼운 폐 슬라이스의 라이브 이미징을 사용하여 감염된 마우스의폐포(13)에서검출되었다. 동시에, 코니디아는마우스(14)의기관지 상피의 발광 측에서 검출되었다.
광학적으로 클리어된 전체 마운트 마우스 폐의 3차원(3D) 이미징은기도(15)의형태측정 분석을 허용한다. 특히, 내장 흉막 신경 분포의 정량분석은 광학적으로 지워진 마우스 폐표본(15)을사용하여 수행되었다. 최근, Amich외. 16은 광학적으로 클리어된 마우스 폐 표본의 광시트 형광 현미경 검사를 이용하여 면역손상마우스에 코니아를 적용한 후 곰팡이 성장을 조사하였다. 감염 후 다른 시점에서 기도에 있는 휴식 코니디아의 정확한 위치는 염증의 특정 단계에서 충분한 항진균 방어를 제공할 수 있는 세포 인구를 확인하는 데 중요합니다. 그러나, 상대적으로 작은 크기로 인해, 기도내A. 후미가투스 코니디아 분포의 현세-측두성 측면은 제대로 특성화되지 않습니다.
여기서, 감염된 마우스의 기도에서 A. fumigatus 코니디아 분포의 정량적 분석을 위한 실험적인 설정을 제시한다. 형광공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)를 사용하여 형광으로 표지된 A. fumigatus 코니디아의 구인두 적용을 받은 마우스의 광학적으로 클리어된 폐의 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)를 사용하여, 3D 영상을 얻고 영상 처리를 수행한다. 전산 폐 엽의 3D 이미징을 사용하여, 우리는 이전에 코니디아 적용 후 72 시간 마우스의 실시기도에서 A. fumigatus 코니디아의 분포를 보여 주었다8.
Protocol
Representative Results
Discussion
전장기 3D 이미징은 시편의 해부 없이 데이터를 얻는 것을 허용하며, 이는 유기체에서 병원체의 해부학적 분포의 공간 적 측면을 조사하는 데 매우 중요합니다. 레이저 광 산란을 극복하고 전신 학습자 이미징15, 16,18,19를허용하는 데 도움이되는 조직 광학 클리어링의 몇 가지 기술 및 변형이 있습니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 아스퍼질러스 후미가투스 코니디아 균주 AfS150을 제공한 스벤 크라프만 교수(대학 병원 에를랑겐과 FUA 에를랑겐-뉘른베르크, 독일)에게 감사를 표합니다. 저자는 MIPT 프레스 오피스에 감사드립니다. V.B. 러시아 연방 과학 고등 교육부 (#075-00337-20-03, 프로젝트 FSMG-2020-0003)를 인정합니다. A. fumigatus 코니디아 이미징 및 정량화에 관한 작업은 RSF No 19-75-00082에 의해 지원되었다. 기도 화상 진찰에 관하여 일은 RFBR No 20-04-60311에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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