Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato
Summary
Descriviamo il metodo per l’analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus conidia (3 μm di dimensione) nelle vie aeree dei topi. Il metodo può anche essere utilizzato per l’analisi della distribuzione di microparticelle e agglomerato di nanoparticelle nelle vie aeree in vari modelli di condizioni patologiche.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia sono agenti patogeni presenti nell’aria che possono penetrare nelle vie aeree umane. Le persone immunocompetenti senza allergie mostrano resistenza e tolleranza immunologica, mentre nei pazienti immunocompromessi, i conidi possono colonizzare le vie aeree e causare gravi disturbi respiratori invasivi. Varie cellule in diversi compartimenti delle vie aeree sono coinvolte nella risposta immunitaria che previene l’invasione fungina; tuttavia, gli aspetti spazio-temporali dell’eliminazione dei patogeni non sono ancora completamente compresi. L’imaging tridimensionale (3D) di organi a montaggio intero otticamente cancellati, in particolare i polmoni di topi sperimentali, consente il rilevamento di agenti patogeni etichettati fluorescentmente nelle vie aeree in diversi punti temporali dopo l’infezione. Nel presente studio, descriviamo una configurazione sperimentale per eseguire un’analisi quantitativa della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree. Utilizzando la microscopia a scansione laser confocale fluorescente (CLSM), abbiamo tracciato la posizione dei conidi etichettati fluorescentemente nei rami bronchiali e nel compartimento alveolare 6 ore dopo l’applicazione orofaringea ai topi. L’approccio qui descritto è stato precedentemente utilizzato per il rilevamento della posizione precisa del patogeno e l’identificazione delle cellule che interagiscono con i patogeni in diverse fasi della risposta immunitaria. La configurazione sperimentale può essere utilizzata per stimare la cinetica dell’eliminazione del patogeno in diverse condizioni patologiche.
Introduction
Su base giornaliera, le persone inalano agenti patogeni presenti nell’aria, comprese le spore di funghi opportunistici Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) che possono penetrare nel tratto respiratorio1. Il tratto respiratorio dei mammiferi è un sistema di vie aeree di diverse generazioni che sono caratterizzate dalle diverse strutture delle pareti delle vie aeree2,3,4. Le pareti tracheobronchiali sono costituite da diversi tipi di cellule tra cui cellule ciliate che forniscono la clearance mucociliare5. Negli alveoli non ci sono cellule ciliate e i patogeni penetranti dello spazio alveolare non possono essere eliminati dalla clearance mucociliare6. Inoltre, ogni generazione di vie aeree è una nicchia per più popolazioni di cellule immunitarie e sottoinsiemi di queste popolazioni sono unici per alcuni compartimenti delle vie aeree. Pertanto, i macrofagi alveolari risiedono nei compartimenti alveolari, mentre sia la trachea che le vie aeree conduttrici sono rivestite con le cellule dendritiche intraepiteliali7,8.
La dimensione approssimativa di A. fumigatus conidia è 2-3,5 μm9. Poiché il diametro delle piccole vie aeree nell’uomo e anche nei topi supera i 3,5 μm, è stato suggerito che i conidi possano penetrare nello spazio alveolare2,10,11. Infatti, l’esame istologico ha mostrato la crescita fungina negli alveoli dei pazienti affetti da aspergillosi12. I conidi sono stati rilevati anche negli alveoli di topi infetti utilizzando l’imaging dal vivo delle spesse fette polmonari13. Allo stesso tempo, i conidi sono stati rilevati nel lato luminale dell’epitelio bronchiale dei topi14.
L’imaging tridimensionale (3D) dei polmoni di topo a montaggio intero otticamente cancellati consente l’analisi morfometrica delle vie aeree15. In particolare, l’analisi quantitativa della distribuzione del nervo pleurico viscerale è stata eseguita utilizzando campioni polmonari di topo otticamente cancellati15. Recentemente, Amich et al.16 hanno studiato la crescita fungina dopo l’applicazione intranasale di conidi ai topi immunocompromessi utilizzando una microscopia a fluorescenza a foglio di luce di campioni polmonari di topo otticamente cancellati. La posizione precisa dei conidi a riposo nelle vie aeree in diversi punti temporali dopo l’infezione è importante per identificare le popolazioni cellulari che possono fornire una sufficiente difesa antifungina in alcune fasi dell’infiammazione. Tuttavia, a causa delle dimensioni relativamente piccole, gli aspetti spazio-temporali della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree sono scarsamente caratterizzati.
Qui, presentiamo una configurazione sperimentale per l’analisi quantitativa della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree di topi infetti. Utilizzando la microscopia a scansione laser confocale fluorescente (CLSM) di polmoni otticamente cancellati di topi che hanno ricevuto un’applicazione orofaringea del conidia fluorescente etichettato A. fumigatus, otteniamo immagini 3D ed eseguiamo l’elaborazione delle immagini. Utilizzando l’imaging 3D del lobo polmonare a monte intero, abbiamo precedentemente mostrato la distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree condutture dei topi 72 ore dopo l’applicazione della conidia8.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imaging 3D dell’intero organo consente di ottenere i dati senza dissezione del campione, che è di grande importanza per indagare gli aspetti spaziali della distribuzione anatomica del patogeno nell’organismo. Esistono diverse tecniche e modifiche della compensazione ottica tissutale che aiutano a superare la diffusione della luce laser e consentono l’imaging di organi interi15,16,18,19. Uno …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Prof. Sven Krappmann (Ospedale Universitario di Erlangen e FUA Erlangen-Norimberga, Germania) per aver fornito il ceppo Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Gli autori ringraziano l’Ufficio Stampa del MIPT. V.B. riconosce il Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore della Federazione Russa (#075-00337-20-03, progetto FSMG-2020-0003). Il lavoro relativo all’imaging e alla quantificazione di A. fumigatus conidia è stato supportato da RSF n. 19-75-00082. Il lavoro relativo all’imaging delle vie aeree è stato supportato da RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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