En rottelungetransplantasjonsmodell av varm iskemi / reperfusjonsskade: optimaliseringer for å forbedre resultatene

Summary

Her presenterer vi optimaliseringer til en rottelungetransplantasjonsmodell som tjener til å forbedre resultatene. Vi tilbyr en størrelsesguide for mansjetter basert på kroppsvekt, en målestrategi for å fastslå det 4. interkostalrommet, og metoder for sårlukking og BAL (bronkoalveolær skylling) væske- og vevsoppsamling^.

Abstract

Fra vår erfaring med rottelungetransplantasjon har vi funnet flere forbedringsområder. Informasjon i eksisterende litteratur om metoder for å velge passende mansjettstørrelser for lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronkus (Br) er variert, noe som gjør bestemmelsen av riktig mansjettstørrelse under rottelungetransplantasjon til en øvelse og feiling. Ved å standardisere mansjettteknikken for å bruke den minste effektive mansjetten som passer for størrelsen på karet eller bronkusen, kan man gjøre transplantasjonsprosedyren tryggere, raskere og mer vellykket. Siden diametrene til PV, PA og Br er relatert til kroppsvekten til rotta, presenterer vi en strategi for å velge en passende størrelse ved hjelp av en vektbasert guide. Siden lungevolum også er relatert til kroppsvekt, anbefaler vi at dette forholdet også bør vurderes når du velger riktig luftvolum for donorlungeinflasjon under varm iskemi, samt for riktig volum av PBS som skal innsettes under væskeansamling av bronkoalveolær skylling (BAL). Vi beskriver også metoder for interkostal romdisseksjon, sårlukking og prøvetaking fra både de innfødte og transplanterte.

Introduction

I over tre tiår har forskere modifisert og forbedret rottelungetransplantasjonsmodeller slik at dataene som genereres er mer konsistente og mer reflekterende for den faktiske kliniske tilstanden. I laboratoriets tid med å utføre denne modellen har vi bestemt fire forbedringsområder: mansjettteknikker for anastomoser, identifisering av mottakerens 4^. interkostalrom, lungeinflasjon og sårlukking under mottakerens prosedyre, og høsting av prøver for analyse.

Modifikasjoner av mansjettteknikk for anastomoser kan forbedre hele transplantasjonsprosedyren ved å forkorte håndteringstiden for donorlungen 1,2,3,4,5,6 og gjøre anastomoseprosedyren raskere og teknisk enklere for mikrokirurgen. Selv om det er viktig å bruke mansjettene av riktig størrelse for å levere nødvendig blod og luftstrøm til den transplanterte lungen, er det begrenset veiledning om hvordan man skal velge størrelsen på mansjettene for lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronkus (Br) 5,7,8,9. Siden diametrene til PV, PA og Br er relatert til kroppsvekten til donor- og mottakerrottene, foreslår vi at mansjettstørrelsen er basert på kroppsvekt. Denne rapporten gir en størrelsesguide for mansjetter basert på rottens kroppsvekt (180 g til over 270 g) som tjener til å optimalisere blod- og lufttilførselen til den transplanterte lungen (tabell 1).

Mens en nyere mikrokirurg med hell og enkelt kan skaffe en donorlunge under donorprosedyren, er transplantasjon av lungen under mottakerens prosedyre mer komplisert og avhengig av mikrokirurgens erfaring. Forsøk på å finne den 4^. interkostalplassen for å få tilgang til mottakerens venstre lunge er en av de vanskeligere trinnene som holder litt subjektivitet og kan øke prosedyretiden. Derfor introduserer vi en enkel og objektiv metode for å hjelpe til med identifiseringen av 4. interkostalromplassering ved å bruke brystmålinger og hjertebank for å finne riktig område brystvegg for å dissekere 4,5,6,10,11,12.

Vi foreslår også en forbedring av donorlungeinflasjonen, som er en potensiell kilde til skade på organet. Donorlungen deflateres inntil reperfusjonen starter. Under suturering av 4^th intercostal plass, blir donorlungen vanligvis oppblåst ved å øke PEEP fra 2 cmH 2 O til 6cmH₂O. For å minimere lungeskade fra overinflasjon, foreslår vi en teknikk der tre 6-0 nylonsuturer plasseres rundt den 4. ribben dårligere enn 5-ribben med enkle doble knuter. Når det er tid for sårlukking, holdes endene av de tre suturene med hemostater i begge hender, såret lukkes på en gang ved å trekke opp på hver side, og PEEP reduseres umiddelbart til 2 cmH₂O. På denne måten får lungen utvide seg kortest mulig¹⁰.

Ved avslutningen av et eksperiment ønsker forskeren ofte å samle inn mange typer prøver for mange typer analyser fra hver transplantasjon. For eksempel kan snap frosset vev, formalin fast vev, vev for våt-til-tørr vektforhold for å bestemme lungeødem, og bronkoalvelolær skylling (BAL) væske alle kan brukes til å vurdere hvor godt transplantasjonen gikk. Den tradisjonelle metoden for å samle BAL-væske tillater en blandet samlet prøve fra både mottakerens innfødte lober og donorens transplanterte lobe^13,14,15. For å overvinne dette presenterer vi en metode for å klemme inn hilarområdene som kan gi mer presis innsikt i tilstanden til de transplanterte og innfødte lungene. I tillegg er volumet av PBS som brukes til å samle BAL-væske fra hver side av lungene, viktig å vurdere fordi BAL-væske inneholder mange løselige faktorer som cytokiner og kjemokiner som måles ved konsentrasjon. Normalisering av volumet av væsken som er innpodet til det estimerte volumet av lungekapasitet kan hjelpe til med sammenligning. Med fire fliker på høyre side og en på venstre side, har hver av rottens fem fliker forskjellig volum og overflateareal¹⁶. Ifølge en tidligere studie om volummåling av lungelapper av Backer og medarbeidere er volumet av høyre lunge av det totale volumet av hele lungen 63 % (4400 mm 3) og venstre 37 % (2500 mm³). Vi anbefaler derfor at volumet av PBS som brukes til å samle opp BAL-væske beregnes som to ganger tidalvolumet (7,2 ml/kg) multiplisert med 63 % for høyre lunge og 37 % for venstre lunge. Ved å bruke denne tilnærmingen kan man bedre kontrollere for variabler som kroppsvekt og timing^10,16.

Alt i alt vil vi i denne rapporten demonstrere noen modifikasjoner av standard eksperimentell modell for rottelungetransplantasjon som kan gjøre prosedyren mer effektiv og øke evnen til å generere mer nøyaktige og rikelig data fra hvert eksperiment.

Protocol

Mannlige Sprague-Dawley-rotter (180-270 g kroppsvekt) ble kjøpt kommersielt (f.eks. Envigo) og ble plassert under patogenfrie forhold ved Ohio State University Animal Facility. Alle prosedyrer ble humant utført i henhold til NIH og National Research Council’s Guide for Humane Care and Use of Laboratory Animals og med godkjenning av The Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC protokoll # 2012A00000135-R2). 1. Første oppsett Sett opp kirurgiske enhet…

Representative Results

For å måle lungeødem ble våt-til-tørrvektforholdet beregnet. Donorens stedegne, den transplanterte og mottakerens opprinnelige ble samlet inn som beskrevet i protokollen og veid umiddelbart for våtvekt, tørket ved 60 °C i 48 timer og veide deretter igjen for tørrvekten. Et økt våt-til-tørr vektforhold vil være en indikasjon på lungeødem. Våre resultater indikerer at den transplanterte hadde en signifikant økning i våt-til-tørr-vektforhold sammenlignet med donorens eller mot…

Discussion

I denne rapporten har vi grepet inn på flere kritiske trinn i en rottelungetransplantasjonsprotokoll for å optimalisere prosedyren. Mens ulike mansjettteknikker for rottelungetransplantasjon har blitt rapportert 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15^<…

Materials

12 Gauge angio-catheter	BD	382277
14 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251717-02
16 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252586-02
18 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251679-02
20 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252527-02
4-0 silk suture	Surgical Specialties Corp.	SP116
6-0 nylon suture	AD Surgical	S-N618R13
7-0 nylon suture	AD Surgical	S-N718SP13
8-0 nylon suture	AD Surgical	XXS-N807T6
Betadine Spray	Avrio Health L.P	UPC 367618160039
Clippers	VWR	MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5668
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Electrocautery	Macan	MV-7A
Endotracheal intubation kit	Kent Scientific	ETI-MSE
Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Halsted-mosquito hemostat	Roboz Surgical Instrument Co	RS-7112
Heparin	Fresnius Medical Care	C504701
Insulin syringe	Life Technologies	B328446
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs	BD	326895
Ketamine	Hikma Pharmaceuticals PLC	NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp	World Precision Instruments	WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved	Micrins	MI1542
Needle holder/Forceps, Straight	Micrins	MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution)	XVIVO Perfusion AB	REF# 19950
PhysioSuite	Kent Scientific	PS-MSTAT-RT	Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor	Roboz Surgical Instrument Co	RS-6560
Saline	PP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-186-10
Scissors	Fine Science Tools	14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific	SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad	Fisherbrand	22-415-469
Surgical Microscope	Leica	M500-N w/ OHS
Syringe 5mL	BD	309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
Xylazine	Korn Pharmaceuticals Corp	NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT351T	Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT261T	Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator	Aesculap, Inc	FT484T