En råttlungtransplantationsmodell av varm ischemi / reperfusionsskada: optimeringar för att förbättra resultaten

Summary

Här presenterar vi optimeringar till en lungtransplantationsmodell för råttor som tjänar till att förbättra resultaten. Vi tillhandahåller en storleksguide för manschetter baserat på kroppsvikt, en mätstrategi för att fastställa det 4^{: e} interkostala utrymmet och metoder för sårförslutning och BAL (bronkoalveolär sköljning) vätska och vävnadsuppsamling.

Abstract

Från vår erfarenhet av lungtransplantation på råtta har vi hittat flera förbättringsområden. Informationen i den befintliga litteraturen om metoder för att välja lämpliga manschettstorlekar för lungvenen (PV), lungartären (PA) eller bronken (Br) varierar, vilket gör bestämningen av korrekt manschettstorlek under lungtransplantation på råtta till en övning av försök och fel. Genom att standardisera manschetttekniken för att använda den minsta effektiva manschetten som är lämplig för kärlets eller bronkens storlek kan man göra transplantationsproceduren säkrare, snabbare och mer framgångsrik. Eftersom diametrar på PV, PA och Br är relaterade till råttans kroppsvikt presenterar vi en strategi för att välja en lämplig storlek med hjälp av en viktbaserad guide. Eftersom lungvolymen också är relaterad till kroppsvikt rekommenderar vi att detta förhållande också bör beaktas vid val av rätt luftvolym för donatorlunginflation under varm ischemi samt för att rätt volym PBS ska införas under bronkoalveolär sköljning (BAL) vätskeuppsamling. Vi beskriver också metoder för 4^{: e} interkostal rymddissektion, sårförslutning och provinsamling från både de inhemska och transplanterade loberna.

Introduction

I över tre decennier har forskare modifierat och förbättrat råttlungtransplantationsmodeller så att de genererade uppgifterna är mer konsekventa och mer reflekterande av det faktiska kliniska tillståndet. Under vårt laboratoriums tid att utföra denna modell har vi bestämt fyra förbättringsområden: manschetttekniker för anastomoser, identifiering av mottagarens 4^{: e} interkostala utrymme, lunginflation och sårförslutning under mottagarens procedur och skörd av prover för analys.

Manschettteknikmodifieringar för anastomoser kan förbättra hela transplantationsproceduren genom att förkorta hanteringstiden för donatorlungan 1,2,3,4,5,6 och göra anastomosproceduren snabbare och tekniskt enklare för mikrokirurgen. Även om det är viktigt att använda manschetter av rätt storlek för att leverera det nödvändiga blod- och luftflödet till den transplanterade lungan, finns det begränsad vägledning om hur man ska välja storleken på manschetter för lungvenen (PV), lungartären (PA) eller bronkus (Br) 5,7,8,9. Eftersom diametrarna för PV, PA och Br är relaterade till kroppsvikten hos donator- och mottagarråttorna, föreslår vi att manschettstorleken baseras på kroppsvikt. Denna rapport ger en storleksguide för manschetter baserat på en råttas kroppsvikt (180 g till över 270 g) som tjänar till att optimera blod- och lufttillförseln till den transplanterade lungan (tabell 1).

Medan en nyare mikrokirurg framgångsrikt och enkelt kan skaffa en donatorlunga under givarproceduren, är transplantation av lungan under mottagarens procedur mer komplicerad och beror på mikrokirurgens erfarenhet. Försök att hitta det 4^{: e} interkostala utrymmet för att komma åt mottagarens vänstra lunga är ett av de svårare stegen som har viss subjektivitet och kan öka procedurtiden. Därför introducerar vi en enkel och objektiv metod för att hjälpa till att identifiera den 4^{: e} interkostala rymdplatsen genom att använda bröstmätningar och hjärtklappning för att hitta rätt område bröstvägg för att dissekera 4,5,6,10,11,12.

Vi föreslår också en förbättring av donatorlunginflationen, som är en potentiell källa till skada på organet. Donatorlungan töms tills reperfusion startar. Vid suturering av det 4^{: e} interkostala utrymmet blåses donatorlungan vanligen upp genom att öka PEEP från 2 cmH 2 O till6 cmH₂O. För att minimera lungskador från överinflation föreslår vi en teknik där tre 6-0 nylonsuturer placeras runt den 4: e ribben sämre än den 5^{: e} ribben med enkla dubbelknutar. När det är dags för sårstängning hålls ändarna på de tre suturerna med hemostater i båda händerna, såret stängs på en gång genom att dra upp på varje sida och PEEP reduceras omedelbart till 2_cmH2O. På detta sätt får lungan expandera under kortast möjliga tid¹⁰.

I slutet av ett experiment vill forskaren ofta samla in många typer av prover för många typer av analyser från varje transplantation. Till exempel kan snapfryst vävnad, formalinfixerad vävnad, vävnad för våt-till-torrviktförhållande för att bestämma lungödem och bronkoalvelolär lavage (BAL) vätska alla användas för att bedöma hur bra transplantationen gick. Den traditionella metoden för att samla BAL-vätska möjliggör ett blandat poolat prov från både mottagarens inhemska lober och donatorns transplanterade lob^13,14,15. För att övervinna detta presenterar vi en metod för att klämma fast hilarområdena som kan ge mer exakt inblick i de transplanterade och inhemska lungornas tillstånd. Dessutom är volymen av PBS som används för att samla BAL-vätska från varje sida av lungorna viktigt att överväga eftersom BAL-vätska innehåller många lösliga faktorer såsom cytokiner och kemokiner som mäts genom koncentration. Normalisering av volymen av vätskan som instilleras till den uppskattade volymen lungkapacitet kan hjälpa till med jämförelse. Med fyra lober på höger sida och en lob på vänster sida har var och en av råttans fem lober en annan volym och yta¹⁶. Enligt en tidigare studie om volymmätning av lunglober av Backer et al. är volymen av hela lungan 63% (4400 mm 3) och vänster lob 37% (2500 mm³). Därför rekommenderar vi att volymen PBS som används för att samla BAL-vätska ska beräknas som två gånger tidalvolymen (7,2 ml / kg) multiplicerat med 63% för höger lunga och 37% för vänster lunga. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan man bättre kontrollera för variabler som kroppsvikt och timing^10,16.

Sammantaget kommer vi i denna rapport att visa några modifieringar av den vanliga experimentella modellen för råttlungtransplantation som kan göra proceduren effektivare och öka förmågan att generera mer exakta och rikliga data från varje experiment.

Protocol

Manliga Sprague-Dawley-råttor (180-270 g kroppsvikt) köptes kommersiellt (t.ex. Envigo) och hölls under patogenfria förhållanden vid Ohio State University Animal Facility. Alla procedurer utfördes humant enligt NIH och National Research Council’s Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals och med godkännande av Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol # 2012A00000135-R2). 1. Första installationen Ställ in kirurgiska enhet…

Representative Results

För att mäta lungödem beräknades förhållandet mellan våt och torr vikt. Donatorns inhemska lob, den transplanterade loben och mottagarens inhemska lob samlades in enligt beskrivningen i protokollet och vägdes omedelbart för våtvikt, torkades vid 60 °C i 48 timmar och vägdes sedan igen för torrvikten. Ett ökat förhållande mellan våt och torr vikt skulle vara en indikation på lungödem. Våra resultat indikerar att den transplanterade loben hade en signifikant ökning av förh…

Discussion

I denna rapport har vi ingripit i flera kritiska steg i ett lungtransplantationsprotokoll för råttor för att optimera proceduren. Medan olika manschetttekniker för lungtransplantation av råttor har rapporterats 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15^…

Materials

12 Gauge angio-catheter	BD	382277
14 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251717-02
16 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252586-02
18 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251679-02
20 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252527-02
4-0 silk suture	Surgical Specialties Corp.	SP116
6-0 nylon suture	AD Surgical	S-N618R13
7-0 nylon suture	AD Surgical	S-N718SP13
8-0 nylon suture	AD Surgical	XXS-N807T6
Betadine Spray	Avrio Health L.P	UPC 367618160039
Clippers	VWR	MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5668
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Electrocautery	Macan	MV-7A
Endotracheal intubation kit	Kent Scientific	ETI-MSE
Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Halsted-mosquito hemostat	Roboz Surgical Instrument Co	RS-7112
Heparin	Fresnius Medical Care	C504701
Insulin syringe	Life Technologies	B328446
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs	BD	326895
Ketamine	Hikma Pharmaceuticals PLC	NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp	World Precision Instruments	WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved	Micrins	MI1542
Needle holder/Forceps, Straight	Micrins	MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution)	XVIVO Perfusion AB	REF# 19950
PhysioSuite	Kent Scientific	PS-MSTAT-RT	Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor	Roboz Surgical Instrument Co	RS-6560
Saline	PP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-186-10
Scissors	Fine Science Tools	14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific	SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad	Fisherbrand	22-415-469
Surgical Microscope	Leica	M500-N w/ OHS
Syringe 5mL	BD	309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
Xylazine	Korn Pharmaceuticals Corp	NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT351T	Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT261T	Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator	Aesculap, Inc	FT484T