Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells
Summary
Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.
Abstract
Het identificeren van liganden die specifiek zijn voor therapeutisch significante celreceptoren is cruciaal voor veel toepassingen, waaronder het ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2) is een belangrijke receptor die mestcelactivatie reguleert en dus de algemene immuunrespons stuurt. Talrijke liganden voor MRGPRX2 zijn geïdentificeerd en omvatten endogene peptiden zoals PAMPs, defensinen, LL-37 en andere eiwitfragmenten (d.w.z. afgebroken albumine). Verdere identificatie van MRGPRX2-specifieke liganden vereist de screening van een groot aantal peptiden (d.w.z. peptidebibliotheek); mestcellen zijn echter moeilijk en duur om in vitro te onderhouden en daarom niet economisch in gebruik voor het screenen van grote aantallen moleculen. Het huidige artikel demonstreert een methode om een bibliotheek van kleine peptidemoleculen te ontwerpen, ontwikkelen en screenen met behulp van MRGPRX2 die HEK-cellen tot expressie brengen. Deze cellijn is relatief eenvoudig en goedkoop te onderhouden en kan worden gebruikt voor in vitro high-throughput analyse. Een calciumgevoelige Fura-2 fluorescerende kleurstof om intracellulaire calciumflux bij activering te markeren, werd gebruikt om de activering te controleren. De verhouding van fluorescentie-intensiteit van Fura-2 bij 510 nm tegen excitatiegolflengten van 340 en 380 nm werd gebruikt om de calciumconcentratie te berekenen. De peptidebibliotheek die werd gebruikt om dit systeem te verifiëren, was gebaseerd op de endogene proadrenomedulline N-terminal 12 (PAMP-12) secretagoge, waarvan bekend is dat het MRGPRX2 bindt met hoge specificiteit en affiniteit. Latere peptiden werden gegenereerd door aminozuur-truncation en alanine scanning technieken toegepast op PAMP-12. De hier beschreven methode is eenvoudig en goedkoop maar robuust voor het screenen van een grote bibliotheek van verbindingen om bindingsdomeinen en andere belangrijke parameters te identificeren die een belangrijke rol spelen bij receptoractivering.
Introduction
Mestcellen zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem en spelen een cruciale rol in zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Mestcellen worden voornamelijk geactiveerd door de binding van een antigeen aan het immunoglobuline E (IgE) – FcεRI-receptorcomplex, of door het onlangs ontdekte mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2-activering is in verband gebracht met verschillende immuun- en ontstekingsziekten en daarom is het belangrijk om het bindingsmechanisme van de receptor aan zijn liganden te begrijpen2. Om dit te doen, werd een bibliotheek van kleine peptidemoleculen ontwikkeld en gescreend tegen MRGPRX2-receptoren die overexpressie hadden in HEK-cellen. In de studie werd de peptidebibliotheek geconstrueerd met behulp van de eenvoudige en veelzijdige technieken van alaninescanning en aminozuur-truncation. Alanine scanning omvat het vervangen van specifieke aminozuren door een alanineresidu. Alanine is klein en neutraal, ontdoet het peptide van de specifieke eigenschappen die worden verleend door het vervangen residu en benadrukt achtereenvolgens de betekenis van de respectieve fysiochemische eigenschappen van het aminozuur in receptorinteracties. Integendeel, bij aminozuurafkapping zijn peptidesequenties zo ontworpen dat het een of meer aminozuurresiduen van de N-terminal, C-terminal of beide mist. Deze set peptiden werd gebruikt om de aminozuursequenties te identificeren die cruciaal zijn voor MRGPRX2-binding.
Ervaring met menselijke mestcellijnen (LAD-2) heeft aangetoond dat deze cellen moeilijk in vitrote kweken en te onderhouden zijn: een verdubbelingstijd van twee weken, dure medium supplementen en directe aandacht vereist tijdens passaging3. Deze eigenschappen maken de cellen ongeschikt voor grootschalige screening van potentiële liganden. Hierin werden stabiel getransfecteerde HEK-cellen die MRGPRX2-receptor (HEK-X2) tot expressie brengen, gebruikt om de peptidebibliotheek1te screenen. HEK-293-cellen worden veel gebruikt en bestudeerd voor de heterologe expressie van oppervlaktereceptoren vanwege hun hoge transfectie-efficiëntie, snellere verdubbelingssnelheid en de noodzaak om niet-dure mediumsupplementen in laboratorium te kweken4. Het protocol om HEK-293 cellijn te transfecteren is aangetoond en is goed ingeburgerd5. HEK-293-cellen die stabiel MRGPRX2-receptor tot expressie brengen (passage 13-19) werden geactiveerd met de peptiden gegenereerd door N-truncation, C-truncation, N + C-truncation en alanine scanning1. Wild type HEK cellen (HEK-WT) (passage 16-21) werden gebruikt als controle. Intracellulaire calciumafgifte bij activering werd gecontroleerd om de op MRGPRX2 gebaseerde activering te bestuderen.
Celactivering door MRGPRX2 wordt gevolgd door een cytosolische calciummobilisatie. Deze gereguleerde intracellulaire calciumafgifte in mestcellen wordt gereguleerd door de store operated calcium entry (SOCE), gecoördineerd door het stromale interactiemolecuul 1 (STIM1); en staat centraal in de immuunresponscascade6,7. Er zijn verschillende methoden gebruikt om de intracellulaire calciumconcentratie te detecteren, waaronder patchklemmen en fluorescerende kleurstoffen8. Van alle beschikbare technieken worden fluorometrische calciumkleurstoffen in conjugatie met verschillende detectietechnieken op grote schaal gebruikt9. Twee soorten fluorometrische kleurstoffen die interesse hebben gekregen, zijn namelijk kleurstoffen met één golflengte zoals Fluo-4 en dubbele golflengte ratiometrische kleurstoffen zoals Indo -1 en Fura-2. Het voordeel dat dual golflengte ratiometrische kleurstoffen brengen ten opzichte van kleurstoffen met één golflengte is dat de ratiometrische kleurstoffen corrigeren voor experimentele fouten zoals kleurstofbelasting, fotobleken en scherpstellen10,11.
Fura-2 acetoxymethylester (Fura-2 AM) is een celdoordringing, groen-fluorescerende kleurstof waarvan de excitatie verschuift naar een lagere golflengte bij calciumbinding. Experimenteel wordt Fura-2 geëxtst bij 340 en 380 nm, terwijl de emissie wordt geregistreerd bij 510 nm. Bij calciumbinding neemt de fluorescerende intensiteit bij 340 nm toe, terwijl die van 380 nm afneemt, zoals weergegeven in figuur 1. Gegevens worden weergegeven als een verhouding van fluorescentie-intensiteit na excitatie bij 340 nm (F340) tot die van intensiteit na excitatie bij 380 nm (F380), d.w.z. F340 / F380. De F340/F380-verhouding is evenredig met intracellulair calcium, waarvan de waarde kan worden berekend met de Grynkiewicz-vergelijking12. Omdat het fluorescentiesignaal wordt verkregen uit de excitatie van de kleurstof op twee golflengten (340 nm en 380 nm), corrigeert de verhouding van de fluorescentiesignalen voor experimentele factoren zoals kleurstofbelasting, kleurstoflekkage, fotobleaching en celdichtheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Calciumsignalering staat centraal bij mestceldegranulatie en is veel gebruikt in de studie van receptor-ligandinteracties, ligandidentificatie en medicijnontdekking14. MRGPRX2 is een recent ontdekte mestcelreceptor waarvan is gebleken dat deze een sleutelrol speelt bij veel ontstekingsziekten zoals jeuk, astma en atopische dermatitis, onder andere2. Bovendien is aangetoond dat verschillende goedgekeurde geneesmiddelen een ontstekingsreactie opwekken via de MRGPRX2-receptor<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR en LDU willen alberta innovates strategic research project, NRC en NSERC-Discovery subsidie voor dit project bedanken.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
