Screening von Peptiden, die MRGPRX2 mit engineered HEK Cells aktivieren

Summary

Techniken zur Erzeugung einer Bibliothek von kurzen Peptiden, die Mastzellen über den MRGPRX2-Rezeptor aktivieren können, werden beschrieben. Zugehörige Techniken sind einfach, kostengünstig und können auf andere Zellrezeptoren ausgeweitet werden.

Abstract

Die Identifizierung von Liganden, die für therapeutisch signifikante Zellrezeptoren spezifisch sind, ist für viele Anwendungen von entscheidender Bedeutung, einschließlich des Designs und der Entwicklung neuer Therapeutika. Mas-verwandter G-Protein-Rezeptor-X2 (MRGPRX2) ist ein wichtiger Rezeptor, der die Mastzellaktivierung reguliert und somit die allgemeine Immunantwort lenkt. Zahlreiche Liganden für MRGPRX2 wurden identifiziert und umfassen endogene Peptide wie PAMPs, Defensine, LL-37 und andere Proteinfragmente (d.h. abgebautes Albumin). Die weitere Identifizierung von MRGPRX2-spezifischen Liganden erfordert das Screening einer großen Anzahl von Peptiden (d. H. Peptidbibliothek); Mastzellen sind jedoch schwierig und teuer in vitro zu pflegen und daher nicht wirtschaftlich für das Screening einer großen Anzahl von Molekülen zu verwenden. Die vorliegende Arbeit demonstriert eine Methode zum Entwerfen, Entwickeln und Screenen einer Bibliothek kleiner Peptidmoleküle unter Verwendung von MRGPRX2-exprimierenden HEK-Zellen. Diese Zelllinie ist relativ einfach und kostengünstig zu warten und kann für in vitro Hochdurchsatzanalysen verwendet werden. Ein calciumempfindlicher Fura-2-Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung des intrazellulären Kalziumflusses bei Aktivierung wurde verwendet, um die Aktivierung zu überwachen. Zur Berechnung der Calciumkonzentration wurde das Verhältnis der Fluoreszenzintensität von Fura-2 bei 510 nm zu Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm verwendet. Die Peptidbibliothek, die zur Verifizierung dieses Systems verwendet wurde, basierte auf dem endogenen Proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) Sekretagog, von dem bekannt ist, dass es MRGPRX2 mit hoher Spezifität und Affinität bindet. Nachfolgende Peptide wurden durch Aminosäurekürzung und Alanin-Scanning-Techniken erzeugt, die auf PAMP-12 angewendet wurden. Die hier beschriebene Methode ist einfach und kostengünstig und dennoch robust für das Screening einer großen Bibliothek von Verbindungen, um Bindungsdomänen und andere wichtige Parameter zu identifizieren, die eine wichtige Rolle bei der Rezeptoraktivierung spielen.

Introduction

Mastzellen sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems und spielen eine entscheidende Rolle sowohl bei angeborenen als auch bei adaptiven Immunantworten. Mastzellen werden in erster Linie entweder durch die Bindung eines Antigens an den Immunglobulin E (IgE) – FcεRI-Rezeptorkomplex oder durch den kürzlich entdeckten mas-verwandten G-Proteinrezeptor-X2 (MRGPRX2)¹aktiviert. Die MRGPRX2-Aktivierung wurde mit mehreren Immun- und Entzündungskrankheiten in Verbindung gebracht, und daher ist es wichtig, den Bindungsmechanismus des Rezeptors an seine Liganden zu verstehen². Dazu wurde eine Bibliothek kleiner Peptidmoleküle entwickelt und gegen MRGPRX2-Rezeptoren gescreent, die in HEK-Zellen überexprimiert wurden. In der Studie wurde die Peptidbibliothek mit den einfachen und vielseitigen Techniken des Alanin-Scannings und der Aminosäurekürzung konstruiert. Beim Alanin-Scanning werden bestimmte Aminosäuren durch einen Alaninrest ersetzt. Da Alanin klein und neutral ist, entfernt es dem Peptid die spezifischen Eigenschaften, die der ersetzte Rückstand verleiht, und unterstreicht nacheinander die Bedeutung der jeweiligen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aminosäure in Rezeptorinteraktionen. Im Gegenteil, bei der Aminosäurekürzung sind Peptidsequenzen so konzipiert, dass ein oder mehrere Aminosäurereste aus dem N-Terminal, C-Terminal oder beiden fehlen. Dieser Satz von Peptiden wurde verwendet, um die Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die für die MRGPRX2-Bindung entscheidend sind.

Die Erfahrung mit menschlichen Mastzellenlinien (LAD-2) hat gezeigt, dass diese Zellen schwer zu kulturieren und in vitrozu pflegen sind: eine Verdopplungszeit von zwei Wochen, teure mittlere Ergänzungen und direkte Aufmerksamkeit während des Passierens^{erforderlich 3}. Diese Eigenschaften machen die Zellen ungeeignet für ein großflächiges Screening potenzieller Liganden. Hierin wurden stabil transfizierte HEK-Zellen, die den MRGPRX2-Rezeptor (HEK-X2) exprimieren, verwendet, um die Peptidbibliothek¹zu screenen. HEK-293-Zellen sind weit verbreitet und werden für die heterologe Expression von Oberflächenrezeptoren aufgrund ihrer hohen Transfektionseffizienz, schnelleren Verdopplungsrate und der Notwendigkeit, untentbstliche mittlere Ergänzungen im Labor kultiviert zu^{werden, untersucht 4}. Das Protokoll zur Transfektiose der HEK-293-Zelllinie wurde nachgewiesen und ist gut etabliert⁵. HEK-293-Zellen, die stabil den MRGPRX2-Rezeptor exprimieren (Passage 13-19), wurden mit den Peptiden aktiviert, die durch N-Kürzung, C-Trunkierung, N + C-Kürzung und Alanin-Scanning erzeugt wurden¹. Wildtyp-HEK-Zellen (HEK-WT) (Passage 16-21) wurden als Kontrolle verwendet. Die intrazelluläre Kalziumfreisetzung bei Aktivierung wurde überwacht, um die MRGPRX2-basierte Aktivierung zu untersuchen.

Auf die Zellaktivierung durch MRGPRX2 folgt eine zytosolische Calciummobilisierung. Diese regulierte intrazelluläre Kalziumfreisetzung in Mastzellen wird durch den speicherbetriebenen Kalziumeintrag (SOCE) reguliert, der durch das stromale Wechselwirkungsmolekül 1 (STIM1) koordiniert wird; und ist zentral für die Immunantwortkaskade^6,7. Verschiedene Methoden wurden verwendet, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration nachzuweisen, einschließlich Patch-Clamps und fluoreszierende Farbstoffe⁸. Von allen verfügbaren Techniken werden fluorometrische Calciumfarbstoffe in Konjugation mit verschiedenen Nachweistechniken weit verbreitet verwendet⁹. Zwei Arten von fluorometrischen Farbstoffen, die Interesse gewonnen haben, sind nämlich Einzelwellenlängenfarbstoffe wie Fluo-4 und duale wellenlängenverhältnismetrische Farbstoffe wie Indo-1 und Fura-2. Der Vorteil, den ratiometrische Farbstoffe mit zwei Wellenlängen gegenüber Farbstoffen mit einer Wellenlänge bringen, besteht darin, dass die ratiometrischen Farbstoffe experimentelle Fehler wie Farbstoffbeladung, Fotobleichen und Fokussieren^{korrigieren 10,11}.

Fura-2-Acetoxymethylester (Fura-2 AM) ist ein zelldurchlässiger, grün fluoreszierender Farbstoff, dessen Anregung sich bei der Calciumbindung auf eine niedrigere Wellenlänge verschiebt. Experimentell wird Fura-2 bei 340 und 380 nm angeregt, während die Emission bei 510 nm aufgezeichnet wird. Bei der Calciumbindung nimmt die Fluoreszenzintensität bei 340 nm zu, während die von 380 nm abnimmt, wie in Abbildung 1gezeigt. Die Daten werden als Verhältnis der Fluoreszenzintensität nach Anregung bei 340 nm (F340) zu der Intensität nach Anregung bei 380 nm (F380) dargestellt, d. h. F340/F380. Das F340/F380-Verhältnis ist proportional zu intrazellulärem Kalzium, dessen Wert durch die Grynkiewicz-Gleichung¹²berechnet werden kann. Da das Fluoreszenzsignal aus der Anregung des Farbstoffs bei zwei Wellenlängen (340 nm und 380 nm) gewonnen wird, korrigiert das Verhältnis der Fluoreszenzsignale experimentelle Faktoren wie Farbstoffbelastung, Farbstoffleckage, Photobleaching und Zelldichten.

Protocol

1. Design und Entwicklung der Peptidbibliothek Um die Liganden des MRGPRX2-Rezeptors der Mastzelle basierend auf einem bekannten Liganden, d. H. PAMP-1213,zu identifizieren, führen Sie die folgenden Schritte aus. Generieren Sie eine N-verkürzte Peptidbibliothek, indem Sie die N-terminalen Aminosäurereste des Liganden nacheinander durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS) abschneiden. Generieren Sie eine C-verkürzte Peptidbibliothek, indem Sie die C-ter…

Representative Results

Tabelle 1 enthält die Peptidsequenzen, die durch terminale Aminosäurekürzung und Alanin-Scanning erzeugt werden. Wie in Tabelle 1gezeigt, fehlt der Peptidsequenz RKKWNKWALSR N-terminales Phenylalanin (F) in Bezug auf sein Mutterteil PAMP-12 und ist daher ein repräsentatives Peptid in der N-verkürzten Bibliothek. In ähnlicher Weise wurde in FRKKWNKWALS PAMP-12 C-terminales Serin entfernt, das eine C-verkürzte Peptidbibliothek darstellt, die von PAMP-12 abgeleitet ist. In der N+C-ve…

Discussion

Die Kalziumsignalisierung ist von zentraler Bedeutung für die Degranulation von Mastzellen und wurde häufig bei der Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Interaktionen, der Ligandenidentifikation und der Wirkstoffforschung^{eingesetzt 14}. MRGPRX2 ist ein kürzlich entdeckter Mastzellrezeptor, der eine Schlüsselrolle bei vielen entzündlichen Erkrankungen wie Juckreiz, Asthma und atopischer Dermatitis spielt, unter anderem². Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mehrere zugelass…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704