שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה באופן חופשי ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות
Summary
חומצות פנוליות הן פיטוכימיקלים חשובים הנמצאים בדגנים מלאים. יש להם תכונות ביו-אקטיביות כגון פונקציות הגנה נוגדות חמצון. עבודה זו נועדה לדווח על שיטה כללית לזיהוי HPLC, הערכת תכולה פנולית כוללת וקביעת היכולת נוגדת החמצון של חומצות פנוליות בדגנים וקטניות.
Abstract
חומצות פנוליות הן סוג של תרכובות אורגניות הנושאות הן קבוצה פנולית והן קבוצה קרבוקסילית. הם נמצאים בדגנים ומתרכזים בסובין של דגנים או בציפוי זרעים של קטניות. הם בעלי תכונות נוגדות חמצון שעוררו עניין מחקרי רב בשנים האחרונות, על תפקודי הבריאות המגנים הפוטנציאליים שלהם. עבודה זו מציגה שיטה כללית למיצוי של חומצות פנוליות מסיסות בחינם מדגנים מלאים וניתוח של יכולת נוגדת החמצון שלהם. נעשה שימוש בחמש דגימות מדגנים מלאים שכללו שני דגנים (חיטה ותירס צהוב) ושלוש קטניות (שעועית פרה, שעועית כליה וסויה). הדגנים נטחנו לקמח והחומצות הפנוליות המסיסות בחופשיות שלהם הופקו באמצעות מתנול מימי. לאחר מכן זוהו התרכובות באמצעות כרומטוגרף נוזלי בלחץ גבוה (HPLC). שיטת Folin-Ciocalteu שימשה לקביעת התכולה הפנולית הכוללת שלהם, בעוד שיכולות נוגדות החמצון שלהם נקבעו באמצעות יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH, יכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC) ויכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC). החומצות הפנוליות שזוהו כללו חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרולית. חומצה ונילית זוהתה רק ב-cowpea בעוד שחומצה קפאית זוהתה רק בפולים בכליות. חומצה p-Coumaric זוהתה בתירס צהוב, פרה וסויה, בעוד שחומצה פרולית זוהתה בכל הדגימות. חומצה פרולית הייתה החומצה הפנולית השלטת שזוהתה. הריכוז הכולל של חומצות פנוליות בדגימות ירד בסדר הבא: פולי סויה > שעועית פרה > תירס צהוב = שעועית כליה > חיטה. היכולת נוגדת החמצון הכוללת (סכום הערכים של מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC) ירדה באופן הבא: פולי סויה > שעועית כליות > תירס צהוב = שעועית פרה > חיטה. מחקר זה הגיע למסקנה כי ניתוח HPLC, כמו גם מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC מספקים מידע שימושי על הרכב החומצה הפנולית ועל התכונות נוגדות החמצון של דגנים מלאים.
Introduction
חומצות פנוליות הן בין הפיטוכימיקלים החשובים ביותר שנחקרו בצמחים בשל התפקיד החיוני שהם ממלאים בהגנה על הצמחים מפני זיהום עשבוני ופטרייתי, כמו גם בשמירה על תמיכה מבנית ושלמות ברקמות הצמח 1,2. הם מצויים בשפע בסובין של דגנים ובמעיל זרעים של קטניות3. מבחינה מבנית, הם מחולקים לשתי קבוצות: החומצות ההידרוקסיבנזואיות (איור 1) וחומצות הידרוקסיצינמיות (איור 2). החומצות ההידרוקסיבנזואיות הנפוצות בדגנים ובקטניות כוללות חומצות גאליות, p-הידרוקסיבנזואיות, 2,4-דיהידרוקסיבנזואיות, פרוטוקאצ’ואיות, וניליות וסירינגיות, בעוד שהחומצות ההידרוקסיצינמיות הנפוצות כוללות חומצות קפאיות, p-קומרית, פרוליות וסינפיות3. לחומצות פנוליות יש גם תכונות נוגדות חמצון, שכן הן מסוגלות לטרוף רדיקלים חופשיים, הגורמים לעופש חמצוני בשומנים, וליזום ולהפיץ עקה חמצונית הנגרמת על ידי רדיקלים במערכות פיזיולוגיות 4,5. בשל תפקיד פיזיולוגי חיוני זה כמו נוגדי חמצון, הם הנושא של המחקר האחרון. הסיבה לכך היא שכאשר הם נצרכים כמרכיבים של מזונות צמחיים, הם יכולים להפעיל הגנה נוגדת חמצון.
דגנים ומוצרי דגנים הם מקורות מזון עיקריים לפחמימות עבור בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם6. דגנים כוללים חיטה, אורז, תירס (תירס), שעורה, טריטיקל, דוחן וסורגום. ביניהם, התירס הוא המנוצל ביותר, עם ניצול עולמי מוערך של 1,135.7 מיליון טון בשנת 2019/2020, ואחריו חיטה עם ניצול עולמי מוערך של 757.5 מיליון טון באותה תקופה7. מזונות דגנים הם מקורות אנרגיה נהדרים לצרכנים שכן הם מקורות עשירים של פחמימות. הם גם מספקים קצת חלבון, שומן, סיבים, ויטמינים ומינרלים6. בנוסף לערכם התזונתי, דגנים הם מקורות טובים לנוגדי חמצון פיטוכימיים, במיוחד חומצות פנוליות, שיש להן פוטנציאל להגן על המערכת הפיזיולוגית מפני נזקי חמצון הנגרמים על ידי רדיקלים3. קטניות הן גם מקורות טובים של חומרים מזינים והן בדרך כלל עשירות יותר בחלבון מאשר דגנים. הם מכילים גם ויטמינים ומינרלים ומשמשים להכנת מזונות שונים8. בנוסף, קטניות הן מקורות טובים למגוון נוגדי חמצון פיטוכימיים, כולל חומצות פנוליות, פלבנואידים, אנתוציאנינים ופרואנתוציאנידינים 9,10. זנים שונים של דגנים וקטניות עשויים להיות בעלי הרכב שונה של חומצה פנולית. לכן יש צורך לחקור את הרכב החומצה הפנולית של דגנים וקטניות ואת הזנים שלהם, על מנת לדעת את היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם ביחס לנוגדי חמצון פנוליים.
מספר בדיקות דווחו על מדידת כמות החומצות הפנוליות בדגנים ובגרגרי קטניות, וקביעת פעילותן נוגדת החמצון. שיטות הניתוח הנפוצות ביותר עבור חומצות פנוליות מדגנים מלאים הן ספקטרופוטומטריה וכרומטוגרפיה נוזלית11. מטרת עבודה זו הייתה להדגים שיטה כרומטוגרפית נוזלית כללית בלחץ גבוה לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה חופשית, ושיטות ספקטרופוטומטריות לקביעת התכולה הפנולית הכוללת והיכולת נוגדת החמצון של חלק מדגנים מלאים וקטניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדגנים המלאים נבחרו כדגני דגנים וקטניות מייצגים שמוצאים שימושים נרחבים במזון ברחבי העולם. בעוד ששינויים עשויים להתקיים בין זנים של כל גרגר, מוקד המחקר הזה היה להדגים שיטה כללית למיצוי ואנליזה של חומצה פנולית בחינם עבור דגנים מלאים. שיטת המיצוי שונתה על ידי הפחתה משמעותית של כמויות הדגימו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בהכרת תודה על התמיכה הטכנית של גב ‘ אליסון סר וגב ‘ האנה אודורו-אובנג, כמו גם על התמיכה בעריכת וידאו על ידי גב ‘ג’ניס פג’רדו ומר מיגל דל רוסאריו.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
