Summary

Tahılların ve baklagillerin serbest çözünür fenolik asit bileşimini ve antioksidan kapasitesini belirlemek için genelleştirilmiş bir yöntem

Published: June 10, 2022
doi:

Summary

Fenolik asitler, kepekli tahıllarda bulunan önemli fitokimyasallardır. Antioksidan koruyucu fonksiyonlar gibi biyoaktif özelliklere sahiptirler. Bu çalışma, HPLC tanımlaması, toplam fenolik içerik tahmini ve tahıl ve baklagillerde fenolik asitlerin antioksidan kapasitesinin belirlenmesi için genelleştirilmiş bir yöntemin raporlanmasını amaçlamıştır.

Abstract

Fenolik asitler, hem fenolik bir grubu hem de bir karboksilik grubu taşıyan bir organik bileşik sınıfıdır. Tahıllarda bulunurlar ve tahılların kepeğinde veya baklagillerin tohum kabuğunda yoğunlaşırlar. Son yıllarda potansiyel antioksidan koruyucu sağlık işlevleri hakkında çok fazla araştırma ilgisi yaratan antioksidan özelliklere sahiptirler. Bu çalışma, serbest çözünür fenolik asitlerin kepekli tahıllardan ekstraksiyonu ve antioksidan kapasitelerinin analizi için genelleştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. İki tahıl (buğday ve sarı mısır) ve üç baklagilden (börülce fasulyesi, barbunya fasulyesi ve soya fasulyesi) oluşan beş tam tahıl örneği kullanılmıştır. Taneler un haline getirildi ve serbest çözünür fenolik asitleri sulu metanol kullanılarak ekstrakte edildi. Bileşikler daha sonra yüksek basınçlı sıvı kromatografı (HPLC) kullanılarak tanımlandı. Toplam fenolik içeriklerini belirlemek için Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılırken, antioksidan kapasiteleri DPPH radikal süpürme kapasitesi, Trolox eşdeğer antioksidan kapasitesi (TEAC) ve oksijen radikal absorbans kapasitesi (ORAC) testleri kullanılarak belirlendi. Tanımlanan fenolik asitler vanillik, kafeik, p-kumarik ve ferulik asitleri içeriyordu. Vanillik asit sadece börülcede tanımlanırken, kafeik asit sadece böbrek fasulyesinde tanımlanmıştır. p-Kumarik asit sarı mısır, börülce ve soya fasulyesinde tanımlanırken, tüm örneklerde ferulik asit tanımlanmıştır. Ferulik asit, tanımlanan baskın fenolik asitti. Numunelerdeki fenolik asitlerin toplam konsantrasyonu aşağıdaki sırayla azalmıştır: soya fasulyesi > börülce fasulyesi > sarı mısır = buğday > barbunya fasulyesi. Toplam antioksidan kapasitesi (DPPH, TEAC ve ORAC tahlillerinin değerlerinin toplamı) aşağıdaki gibi azalmıştır: soya fasulyesi > böbrek fasulyesi > sarı mısır = börülce fasulyesi > buğday. Bu çalışma, HPLC analizinin yanı sıra DPPH, TEAC ve ORAC tahlillerinin kepekli tahılların fenolik asit bileşimi ve antioksidan özellikleri hakkında yararlı bilgiler sağladığı sonucuna varmıştır.

Introduction

Fenolik asitler, otçul ve mantar enfeksiyonuna karşı bitki savunmasında oynadıkları hayati rol ve bitki dokularında yapısal destek ve bütünlüğün korunmasından dolayı bitkilerde incelenen en önemli fitokimyasallar arasındadır 1,2. Tahılların kepeğinde ve baklagillerin tohum kabuğunda bol miktarda bulunurlar3. Yapısal olarak, iki gruba ayrılırlar: hidroksibenzoik asitler (Şekil 1) ve hidroksisinnamik asitler (Şekil 2). Tahıllarda ve baklagillerde yaygın hidroksibenzoik asitler gallik, p-hidroksibenzoik, 2,4-dihidroksibenzoik, protokateşik, vanillik ve şırıngalik asitleri içerirken, yaygın hidroksisinnamik asitler kafeik, p-kumarik, ferulik ve sinapik asitleri içerir3. Fenolik asitler ayrıca yağlarda oksidatif kokululuğa neden olan serbest radikalleri temizleyebildikleri ve fizyolojik sistemlerde radikal kaynaklı oksidatif stresi başlatıp çoğaltabildikleri için antioksidan özelliklere sahiptirler 4,5. Antioksidanlar olarak bu hayati fizyolojik rol nedeniyle, son araştırmaların konusudur. Bunun nedeni, bitkisel gıdaların bileşenleri olarak tüketildiğinde, antioksidan koruma uygulayabilmeleridir.

Tahıllar ve tahıl ürünleri, dünya çapında insanlar ve hayvanlar için başlıca karbonhidrat besin kaynaklarıdır6. Tahıllar arasında buğday, pirinç, mısır (mısır), arpa, tritikale, darı ve sorgum bulunur. Bunlar arasında, 2019/2020 yıllarında tahmini 1.135,7 milyon ton küresel kullanım ile mısır en çok kullanılanıdır, bunu aynı dönemde tahmini 757,5 milyon ton küresel kullanım ile buğday izlemektedir7. Tahıl gıdaları, zengin karbonhidrat kaynakları oldukları için tüketiciler için harika enerji kaynaklarıdır. Ayrıca bazı protein, yağ, lif, vitamin ve mineraller sağlarlar6. Besin değerlerine ek olarak, tahıllar, fizyolojik sistemi radikal kaynaklı oksidatif hasardan koruma potansiyeline sahip fitokimyasal antioksidanların, özellikle fenolik asitlerin iyi kaynaklarıdır3. Baklagiller de iyi besin kaynaklarıdır ve genellikle protein bakımından tahıllardan daha yüksektir. Ayrıca vitamin ve mineral içerirler ve çeşitli yiyeceklerin hazırlanmasında kullanılırlar8. Ek olarak, baklagiller fenolik asitler, flavonoidler, antosiyaninler ve proantosiyanidinler 9,10 dahil olmak üzere çeşitli fitokimyasal antioksidanların iyi kaynaklarıdır. Farklı tahıl ve baklagil çeşitleri farklı bir fenolik asit bileşimine sahip olabilir. Bu nedenle, fenolik antioksidanlarla ilgili potansiyel sağlık yararlarını bilmek için tahılların ve baklagillerin fenolik asit bileşimini ve çeşitlerini incelemeye ihtiyaç vardır.

Tahıl ve baklagil tanelerindeki fenolik asitlerin miktarını ölçmek ve antioksidan aktivitelerini belirlemek için bir dizi tahlil bildirilmiştir. Tam tahıllı fenolik asitler için en yaygın analiz yöntemleri spektrofotometri ve sıvı kromatografisi11’dir. Bu çalışmanın amacı, serbest çözünür fenolik asit bileşimini belirlemek için genelleştirilmiş yüksek basınçlı sıvı kromatografik bir yöntem ve bazı tam tahıllı tahılların ve baklagillerin toplam fenolik içeriğini ve antioksidan kapasitesini belirlemek için spektrofotometrik yöntemleri göstermektir.

Protocol

1. Numune türü Bu çalışma için iki tahıl (örneğin, durum buğdayı ve sarı mısır) ve üç baklagilden (örneğin, Blackeye börülce fasulyesi, soya fasulyesi ve kırmızı barbunya fasulyesi) oluşan beş tam tahıl örneği kullanın. Her bir tahılın 50 gramını bir kahve değirmeni kullanarak üç kat un haline getirin ve 500 μm’lik bir elek ile geçirin. Bunları -20 °C’de saklayın. 2. Numune hazırlama</…

Representative Results

Tablo 2, tahıl ve baklagil tanelerinde tanımlanan fenolik asitleri göstermektedir. Mevcut otantik standartlara dayanarak, örneklerde dört fenolik asit tanımlanmıştır ve bunlar: vanillik, kafeik, p-kumarik ve ferulik asitler. Vanillik asit bir hidroksibenzoik asittir, diğer üçü ise hidroksisinnamik asitlerdir. Vanillik asit sadece Blackeye börülce fasulyesinde tanımlanırken, kafeik asit sadece böbrek fasulyesinde tanımlanmıştır. p-Kumarik asit sarı mısır, börül…

Discussion

Kepekli tahıllar, dünya çapında geniş gıda uygulamaları bulan temsili tahıl taneleri ve baklagiller olarak seçildi. Her tahılın çeşitleri arasında farklılıklar olsa da, bu çalışmanın odak noktası, tam tahıllar için serbest fenolik asit ekstraksiyonu ve analizi için genelleştirilmiş bir yöntem göstermekti. Ekstraksiyon yöntemi, bu tür deneyler yapıldığında çevreye salınacak kimyasalların miktarını azaltmak için numune ve çözücü miktarlarını önemli ölçüde azaltarak değişt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Bayan Alison Ser ve Bayan Hannah Oduro-Obeng’in teknik desteğinin yanı sıra Bayan Janice Fajardo ve Bay Miguel del Rosario’nun video düzenleme desteğini minnetle kabul etmektedir.

Materials

15 mL Falcon conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
2 mL Amber glass ID Surestop vial Thermo Scientific C5000-2W
2 mL Amber microcentrifuge tubes VWR 20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Sigma-Aldrich 440914-100G
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, Sigma Aldrich A1888-2G
2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) Sigma Aldrich D913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% Fluka Chemika 56510
9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps Thermo Scientific 60180-670
96 well flat bottom plates Fisher Scientific 12565501
Agilent BioTek ELx800 microplate reader Fisher Scientific BT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System Fisher Scientific N/A
Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader Fisher Scientific N/A
Analytical balance SI-114 Denver Instrument SI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus Waters WAT078900
BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip BD 309657
Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 Millipore Sigma Z245143
Corning LSE Vortex Mixer Corning 6775
Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) Merck Millipore Ltd HVLP04700 
Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) Merck Millipore Ltd HVHP04700
Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL Eppendorf 3123000071
Eppendorf Research plus, 100-1000 µL Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research plus, 10-100 µL Eppendorf 3123000047
Ethyl acetate, HPLC grade Fisher Chemical E195-4
Ferulic acid standard Sigma Aldrich 128708-5G
Fluorescein Fisher Scientific AC119245000
Folin & Ciocalteu phenol reagent Sigma Aldrich F9252
Formic acid, 99% Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a 27048-0010
Gallic acid standard Sigma G7384
High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 Waters 960402
Methanol, HPLC grade Fisher Chemical A452-4
Micro pipet tips, 0.5-10 µL Fisherbrand 21-197-2F
Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge Thermo Scientific 75002435
Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL Sartorius 728240
Photodiode array detector, Waters 2996 Waters 720000350EN
Pipet tips, 1000 µL VWR 83007-382
Pipet tips, 1-5 mL VWR 82018-840
Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% Sigma Aldrich 216224-100G
Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) Fisher Scientific P288-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom Corning 4321-250
Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ Thermo Scientific 17326-103030
Roto evaporator, IKA RV 10 IKA  0010005185
Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous Fisher Chemical S263-1
Sodium chloride (NaCl) Mallinckrodt AR® 7581
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) Fisher bioreagents BP329-500
Standardization pipet tips 0-200µL Fisherbrand 02-681-134
Syringe Driven Filter unit (0.22 µm)  Millex®-GV SLGVR04NL
Target micro-serts vial insert (400 µL) Thermo Scientific C4011-631
Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) Millipore ZRQSVP030

References

  1. Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
  2. Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
  3. Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
  4. Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
  5. Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
  6. Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
  7. FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
  8. Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
  9. Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
  10. Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
  11. Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
  12. AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
  13. Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
  14. Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
  15. Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
  16. Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  17. Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
  18. Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
  19. Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
  20. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  21. Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
  22. Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
  23. Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).

Play Video

Cite This Article
Apea-Bah, F. B., Drawbridge, P., Beta, T. A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes. J. Vis. Exp. (184), e62467, doi:10.3791/62467 (2022).

View Video