Méthode généralisée de détermination de la composition en acide phénolique soluble libre et de la capacité antioxydante des céréales et des légumineuses
Summary
Les acides phénoliques sont des composés phytochimiques importants présents dans les grains entiers. Ils possèdent des propriétés bioactives telles que des fonctions protectrices antioxydantes. Ces travaux visaient à rendre compte d’une méthode généralisée pour l’identification HPLC, l’estimation de la teneur totale en phénols et la détermination de la capacité antioxydante des acides phénoliques dans les céréales et les légumineuses.
Abstract
Les acides phénoliques sont une classe de composés organiques qui portent à la fois un groupe phénolique et un groupe carboxylique. On les trouve dans les céréales et les concentrent dans le son des céréales ou dans les téguments des légumineuses. Ils possèdent des propriétés antioxydantes qui ont suscité beaucoup d’intérêt de la recherche ces dernières années, sur leurs fonctions potentielles de protection antioxydante pour la santé. Ce travail présente une méthode généralisée pour l’extraction d’acides phénoliques solubles libres à partir de grains entiers et l’analyse de leur capacité antioxydante. Cinq échantillons de grains entiers comprenant deux céréales (blé et maïs jaune) et trois légumineuses (haricot de vache, haricot et soja) ont été utilisés. Les grains ont été moulus en farine et leurs acides phénoliques solubles libres ont été extraits à l’aide de méthanol aqueux. Les composés ont ensuite été identifiés à l’aide d’un chromatographe liquide à haute pression (CLHP). La méthode Folin-Ciocalteu a été utilisée pour déterminer leur teneur totale en phénols, tandis que leurs capacités antioxydantes ont été déterminées à l’aide de la capacité de piégeage des radicaux DPPH, de la capacité antioxydante équivalente Trolox (TEAC) et de la capacité d’absorption des radicaux oxygénés (ORAC). Les acides phénoliques identifiés comprenaient les acides vanillique, caféique, p-coumarique et férulique. L’acide vanillique n’a été identifié que dans le niébé tandis que l’acide caféique n’a été identifié que dans le haricot rouge. L’acide p-coumarique a été identifié dans le maïs jaune, le niébé et le soja, tandis que l’acide férulique a été identifié dans tous les échantillons. L’acide férulique était l’acide phénolique prédominant identifié. La concentration totale d’acides phénoliques dans les échantillons a diminué dans l’ordre suivant : soja > haricot de niébé > maïs jaune = haricot rouge > blé. La capacité antioxydante totale (somme des valeurs des dosages DPPH, TEAC et ORAC) a diminué comme suit : soja > haricot rouge > maïs jaune = haricot de niébé > blé. Cette étude a conclu que l’analyse CLHP ainsi que les tests DPPH, TEAC et ORAC fournissent des informations utiles sur la composition en acide phénolique et les propriétés antioxydantes des grains entiers.
Introduction
Les acides phénoliques sont parmi les composés phytochimiques les plus importants étudiés chez les plantes en raison du rôle vital qu’ils jouent dans la défense des plantes contre l’herbivorie et les infections fongiques, ainsi que dans le maintien du soutien structurel et de l’intégrité des tissus végétaux 1,2. Ils sont abondants dans le son des céréales et le tégument des légumineuses3. Structurellement, ils sont divisés en deux groupes : les acides hydroxybenzoïques (Figure 1) et les acides hydroxycinnamiques (Figure 2). Les acides hydroxybenzoïques communs dans les céréales et les légumineuses comprennent les acides gallique, p-hydroxybenzoïque, 2,4-dihydroxybenzoïque, protocatéchuique, vanillique et syringique, tandis que les acides hydroxycinnamiques courants comprennent les acides caféique, p-coumarique, férulique et sinaïque3. Les acides phénoliques possèdent également des propriétés antioxydantes puisqu’ils sont capables de piéger les radicaux libres, qui provoquent le rancissement oxydatif des graisses, et d’initier et de propager le stress oxydatif induit par les radicaux dans les systèmes physiologiques 4,5. En raison de ce rôle physiologique vital en tant qu’antioxydants, ils font l’objet de recherches récentes. En effet, lorsqu’ils sont consommés en tant que composants d’aliments végétaux, ils peuvent exercer une protection antioxydante.
Les céréales et les produits céréaliers sont les principales sources alimentaires glucidiques pour les humains et les animaux dans le monde6. Les céréales comprennent le blé, le riz, le maïs, l’orge, le triticale, le mil et le sorgho. Parmi eux, le maïs est le plus utilisé, avec une utilisation mondiale estimée à 1 135,7 millions de tonnes en 2019/2020, suivi du blé avec une utilisation mondiale estimée à 757,5 millions de tonnes au cours de la même période7. Les aliments céréaliers sont d’excellentes sources d’énergie pour les consommateurs car ils sont riches en glucides. Ils fournissent également des protéines, des graisses, des fibres, des vitamines et des minéraux6. En plus de leur valeur nutritive, les céréales sont de bonnes sources d’antioxydants phytochimiques, en particulier les acides phénoliques, qui ont le potentiel de protéger le système physiologique contre les dommages oxydatifs induits par les radicaux3. Les légumineuses sont également de bonnes sources de nutriments et sont généralement plus riches en protéines que les céréales. Ils contiennent également des vitamines et des minéraux et sont utilisés dans la préparation de divers aliments8. De plus, les légumineuses sont de bonnes sources d’une variété d’antioxydants phytochimiques, y compris les acides phénoliques, les flavonoïdes, les anthocyanes et les proanthocyanidines 9,10. Différentes variétés de céréales et de légumineuses peuvent avoir une composition en acide phénolique différente. Il est donc nécessaire d’étudier la composition en acide phénolique des céréales et des légumineuses et de leurs variétés, afin de connaître leurs avantages potentiels pour la santé en ce qui concerne les antioxydants phénoliques.
Un certain nombre d’essais ont été rapportés pour mesurer la quantité d’acides phénoliques dans les céréales et les légumineuses, et déterminer leurs activités antioxydantes. Les méthodes d’analyse les plus courantes des acides phénoliques à grains entiers sont la spectrophotométrie et la chromatographie liquide11. L’objectif de ces travaux était de démontrer une méthode généralisée de chromatographie liquide à haute pression pour déterminer la composition en acide phénolique soluble libre, et des méthodes spectrophotométriques pour déterminer la teneur totale en phénol et la capacité antioxydante de certaines céréales à grains entiers et légumineuses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les grains entiers ont été sélectionnés comme grains de céréales et légumineuses représentatifs qui trouvent de larges applications alimentaires dans le monde entier. Bien que des variations puissent exister entre les cultivars de chaque grain, l’objectif de cette étude était de démontrer une méthode généralisée d’extraction et d’analyse de l’acide phénolique libre pour les grains entiers. La méthode d’extraction a été modifiée en réduisant considérablement les quantités d’échantillons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mme Alison Ser et Mme Hannah Oduro-Obeng pour le soutien technique de Mme Alison Ser et de Mme Hannah Oduro-Obeng, ainsi que pour le soutien au montage vidéo de Mme Janice Fajardo et de M. Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
