Valutazione funzionale della barriera a giunzione stretta intestinale e della permeabilità agli ioni nel tessuto nativo mediante la tecnica della camera di Ussing
Summary
L’epitelio intestinale conferisce non solo assorbimento dei nutrienti, ma protezione contro le sostanze nocive. La giunzione intercellulare apicale più epiteliale, cioè la giunzione stretta, regola la permeabilità paracellulare del soluto e degli ioni. Qui viene descritto un protocollo per la preparazione di fogli mucosi e la valutazione della selettività ionica di giunzioni strette utilizzando la tecnica della camera di Ussing.
Abstract
La tecnica della camera di Ussing fu inventata per la prima volta dallo scienziato danese Hans Ussing nel 1951 per studiare il trasporto transcellulare di sodio attraverso la pelle di rana. Da allora, questa tecnica è stata applicata a molti tessuti diversi per studiare i parametri fisiologici del trasporto attraverso le membrane. Il metodo della camera di Ussing è preferibile ad altri metodi perché è possibile utilizzare il tessuto nativo, rendendolo più applicabile a ciò che sta accadendo in vivo. Tuttavia, poiché viene utilizzato tessuto nativo, la produttività è bassa, il tempo è limitato e la preparazione dei tessuti richiede abilità e formazione. Queste camere sono state utilizzate per studiare specifiche proteine trasportatrici in vari tessuti, comprendere la fisiopatologia della malattia come nella fibrosi cistica, studiare il trasporto e l’assorbimento dei farmaci e soprattutto hanno contribuito alla comprensione del trasporto dei nutrienti nell’intestino. Dato l’intero processo di trasporto epiteliale di un tessuto, non solo le vie transepiteliali, ma anche le vie paracellulari sono importanti. Le giunzioni strette sono un fattore determinante della permeabilità paracellulare specifica del tessuto attraverso l’intestino. In questo articolo, la tecnica della camera di Ussing sarà utilizzata per valutare la permselectività paracellulare degli ioni misurando la conduttanza transepiteliale e i potenziali di diluizione.
Introduction
Il metodo della camera di Ussing è stato sviluppato per la prima volta dallo scienziato danese Hans Ussing. Ussing lo ha usato per la prima volta per misurare la corrente di cortocircuito del trasporto di sodio attraverso la pelle di rana dopo che è stato osservato che naCl poteva essere trasportato attraverso la pelle contro un forte gradiente di concentrazione1. Il suo sistema consisteva nella pelle di rana montata tra due camere con accesso a entrambi i lati della pelle. Ogni camera conteneva la soluzione di Ringer che veniva fatta circolare e aerata. Due stretti ponti di suoneria di agar situati vicino alla pelle e collegati a elettrodi saturi di KCl-calomel hanno misurato la differenza di potenziale come letto da un potenziatore. Una seconda coppia di ponti di suoneria di agar era situata all’estremità opposta di ogni camera collegata a becher con KCl saturo saturo di AgCl per applicare una forza elettromotrice fornita da una batteria. Un divisore di potenziale è stato utilizzato per regolare la tensione in modo che la differenza di potenziale attraverso la pelle rimanesse zero, creando così condizioni di cortocircuito. È stato inoltre collegato un misuratore di microampere per leggere la corrente che passa attraverso la pelle (vedi la figura in ref.1 per il design originale della camera).
Negli ultimi 70 anni, questa tecnica è stata applicata a molti tessuti diversi, in particolare il tessuto intestinale, per studiare il trasporto di nutrienti e ioni. Ad esempio, il meccanismo della diarrea indotta dal colera è stato studiato montando l’ileo di coniglio in queste camere e si è scoperto che la diarrea indotta dalla tossina del colera è mediata da cAMP2. Inoltre, queste camere sono state utilizzate anche per studiare il meccanismo alla base del trasporto del glucosio tramite il cotrasportatore Na+-Glucosio 1 (SGLT1)3. Il nostro laboratorio si concentra sul trasporto transcellulare e paracellulare nelle cellule epiteliali intestinali. Utilizzando il metodo della camera di Ussing, il trasporto peptidico è stato valutato in Topi knockout claudin 15, che hanno alterato il trasporto paracellulare del sodio, utilizzando le camere di Ussing per misurare l’assorbimento della glicilsarcosina dipeptide non idrolizzabile. Si è scoperto che l’omeostasi luminale Na+ è importante per il trasporto peptidico accoppiato a protoni4. Inoltre, queste camere sono state utilizzate anche per studiare la secrezione di anioni nel cieco murino in risposta all’attivazione sottomucosa del recettore 1 attivato dalla proteinasi dalla serina proteasi tripsina5.
Le camere di Ussing sono state recentemente utilizzate anche per valutare le vie paracellulari nel tessuto epiteliale. Le vie paracellulari sono regolate da giunzioni strette, che sono complessi di proteine che si formano nel punto in cui due o più cellule si incontrano6. La funzione barriera e la selettività ionica (se anioni o cationi sono selettivamente in grado di passare attraverso la giunzione stretta) è determinata dalla presenza di proteine della famiglia della claudina; alcuni dei quali fungono da barriere (claudina 3 e 7), pori anionici (claudina 10a) o pori cationici (claudina 2, 10b e 15)7. Altri metodi sono stati utilizzati per valutare la via paracellulare, come il gavage orale di FITC accompagnato dalla concentrazione di FITC plasmatico8 o EDTA-Cr9; tuttavia, queste tecniche sono di risoluzione inferiore e non possono valutare la selettività ionica o una sezione specifica delle sezioni del tratto intestinale. Le camere di ussing, tuttavia, possono essere utilizzate per valutare il potenziale di diluizione degli ioni bersaglio e, quindi, determinare la selettività ionica delle giunzioni strette. Ad esempio, con NaCl, la selettività delle giunzioni strette per Na+ e Cl– può essere calcolata diluendo un lato della membrana (di solito il lato della mucosa) e misurando il cambiamento nella differenza di potenziale transepiteliale. Le permeabilità relative di Na+ e Cl– possono essere stimate dall’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz10 e la selettività della giunzione stretta può essere stimata utilizzando l’equazione di Kimizuka-Koketsu11. Queste camere, quindi, hanno il vantaggio di misurare i parametri elettrofisiologici del tessuto e di conseguenza forniscono maggiori informazioni sul passaggio degli ioni attraverso le giunzioni strette rispetto ad altri metodi a bassa risoluzione.
Il metodo della camera di Ussing non è limitato solo al tratto intestinale, sebbene sia ampiamente utilizzato negli studi riguardanti l’intestino, ma ha anche molte altre applicazioni. Ad esempio, queste camere sono state utilizzate per studiare la fibrosi cistica, e in particolare il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica del canale del cloruro (CFTR)12. La fibrosi cistica è causata da una mutazione in CFTR13, che si traduce in una compromissione della secrezione di cloruro e del trasporto di liquidi da parte delle cellule epiteliali respiratorie e in un risultante strato mucoso più spesso e secco14. Lo studio del CFTR epiteliale delle vie aeree è stato eseguito con queste camere non solo per comprendere la malattia, ma anche per scoprire modi per trattare la malattia. Ad esempio, nei pazienti con mutazioni rare che causano la fibrosi cistica, l’analisi delle cellule epiteliali respiratorie del paziente è stata utilizzata per testare terapie come Orkambi e una co-terapia amplificatore15.
Le camere di ussing sono state utilizzate anche per studiare le vie di somministrazione del farmaco, ad esempio con il tessuto bioptico umano per studiare l’assorbimento del farmaco e la farmacocinetica16. L’assorbimento intestinale non è l’unica via di somministrazione del farmaco. Queste camere sono state utilizzate anche per studiare i sistemi di somministrazione nasale dei farmaci17. Studi di somministrazione di farmaci con camere di Ussing sono stati eseguiti anche per l’occhio. Nella cornea del coniglio, sono stati condotti studi di permeabilità e assorbimento con Labrasol, un farmaco progettato per aumentare l’assorbimento dei farmaci attraverso i tessuti18. Un altro studio ha esaminato l’effetto del benzilalconio cloruro sulla somministrazione transsclerale di farmaci nella sclera di coniglio19.
Il metodo della camera di Ussing è utile perché è possibile utilizzare il tessuto nativo. Come tale, è preferibile rispetto a modelli in vitro come le linee cellulari Caco-2. Tuttavia, la tecnica richiede abilità e tempo per preparare i campioni, quindi non è adatta per applicazioni ad alto rendimento. Le proprietà elettrofisiologiche dei monostrati cellulari possono essere studiate utilizzando inserti di coltura cellulare in queste camere. Recenti scoperte hanno permesso la coltura di organoidi che sono mini-organi coltivati in coltura dal prelievo di cellule staminali epiteliali o endoteliali20. La coltura organoide può essere manipolata per essere coltivata in un monostrato, rendendo così possibile il montaggio di organoidi in una camera di Ussing21. Gli organoidi di vari tessuti epiteliali ed endoteliali possono essere studiati, riducendo il numero di animali richiesti, poiché la coltura organoide può essere mantenuta a lungo termine. Ciò aumenterà anche la produttività poiché non saranno necessarie lunghe e laboriose fasi di dissezione e preparazione dei tessuti. In futuro, gli studi sulla camera di Ussing continueranno ad essere molto utili per studiare il trasporto dei tessuti e saranno particolarmente importanti nel campo della medicina personalizzata.
Il seguente protocollo dimostra l’applicazione del metodo della camera di Ussing per valutare la permselectivity e la funzione di barriera delle giunzioni strette nell’intestino tenue di topi Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) e controlli wild type (WT) misurando il potenziale di diluizione di NaCl. Le giunzioni strette (TJ) si formano nel punto in cui due o più cellule si incontrano nel tessuto epiteliale ed endoteliale. Si ritiene che le giunzioni strette bicellulari (bTJ), in particolare le proteine della famiglia della claudina presenti all’interno del bTJ, determinino la funzione barriera e la permselettività di TJ7. I topi Cldn15-/- hanno un mega intestino tenue22 e una ridotta capacità di assorbimento dei nutrienti a causa della perdita di riciclaggio intestinale di Na+ che si verifica tramite claudina 154,23,24. I topi Cldn15-/- hanno compromesso l’omeostasi Na+, il che li rende un modello interessante per studiare la permselettività del TJ. Il seguente protocollo valuta la permeabilità del TJ al NaCl misurando il potenziale di diluizione del NaCl (PNa/PCl) nell’intestino tenue medio. In breve, il cambiamento nella differenza di potenziale di membrana che si verifica diluendo un lato della membrana (lato M o lato S, entrambi sono misurati nel protocollo sottostante) può essere utilizzato per calcolare la permeabilità di Na+ (PNa) e Cl– (PCl), e il potenziale di diluizione (PNa / PCl) mostrerà se la giunzione stretta ha una selettività cationica o anionica.
Gli esperimenti in questo protocollo sono stati condotti utilizzando una camera di Ussing personalizzata (Figura 1A), che consiste di due metà, tra le quali la preparazione intestinale è montata verticalmente, amplificatore a morsetto di tensione, registratore elettrico, elettrodi, ponti di sale, soluzione di Ringer, tampone HEPES (150 mM NaCl), tampone HEPES diluito (75 mM NaCl), preparazione intestinale (per i dettagli sulle apparecchiature vedere la Tabella dei materiali).
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo esperimento, le camere di Ussing sono state utilizzate per misurare i parametri elettrici di base e il potenziale di diluizione di NaCl nell’intestino tenue di topi Cldn15-/- e WT. È molto importante quando si eseguono esperimenti con camera di Ussing verificare che la preparazione della membrana utilizzata negli esperimenti sia praticabile. Questo di solito viene fatto aggiungendo glucosio o l’attivatore dell’adenilato ciclasi forskolin e vedendo se c’è un aumento appropriato di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da 17K00860 (a HH) e 19K20152 (a NI). WH desidera ringraziare la Otsuka Toshimi Scholarship Foundation per il suo sostegno finanziario dal 2018 al 2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
