Функциональная оценка барьера плотного соединения кишечника и ионной проницаемости в нативной ткани с помощью метода использования камеры
Summary
Кишечный эпителий обеспечивает не только всасывание питательных веществ, но и защиту от вредных веществ. Наиболее апикально-эпителиальное межклеточное соединение, т. е. плотное соединение, регулирует параклеточную растворенную и ионную проницаемость. Здесь описан протокол подготовки листов слизистой оболочки и оценки селективности ионов плотных соединений методом камеры Уссинга.
Abstract
Метод камеры Уссинга был впервые изобретен датским ученым Хансом Уссингом в 1951 году для изучения трансклеточного транспорта натрия через кожу лягушки. С тех пор этот метод был применен ко многим различным тканям для изучения физиологических параметров транспорта через мембраны. Метод камеры Юссинга предпочтительнее других методов, потому что можно использовать нативную ткань, что делает его более применимым к тому, что происходит in vivo. Однако, поскольку используется нативная ткань, пропускная способность низкая, время ограничено, а подготовка тканей требует навыков и обучения. Эти камеры использовались для изучения специфических белков-транспортеров в различных тканях, понимания патофизиологии заболеваний, таких как при муковисцидозе, изучения транспорта и поглощения лекарств и особенно способствовали пониманию транспорта питательных веществ в кишечнике. Учитывая весь процесс эпителиального транспорта ткани, важны не только трансэпителиальные пути, но и параклеточные пути. Плотные соединения являются ключевым фактором, определяющим тканеспецифическую параклеточную проницаемость по всему кишечнику. В этой статье метод камеры Уссинга будет использоваться для оценки параклеточной пермселективности ионов путем измерения трансэпителиальной проводимости и потенциалов разбавления.
Introduction
Метод камеры Уссинга был впервые разработан датским ученым Хансом Уссингом. Уссинг впервые использовал его для измерения тока короткого замыкания транспорта натрия через кожу лягушки после того, как было замечено, что NaCl может транспортироваться через кожу против крутого градиента концентрации1. Его система состояла из лягушачьей шкуры, установленной между двумя камерами с доступом к обеим сторонам кожи. Каждая камера содержала раствор Рингера, который циркулировал и аэрировался. Два узких агаровых звеньевых моста, расположенных рядом с кожей и соединенных с насыщенными электродами KCl-каломеля, измеряли разность потенциалов, считываемую потенциатором. Вторая пара агаровых кольцевых мостиков была расположена на противоположном конце каждой камеры, соединенной с стаканами с насыщенным KCl, насыщенным AgCl, для приложения электродвижущей силы, обеспечиваемой батареей. Делитель потенциалов использовался для регулировки напряжения таким образом, чтобы разность потенциалов по всей коже оставалась нулевой, создавая тем самым условия короткого замыкания. Микроамперометр также был подключен для считывания тока, проходящего через кожу (см. рисунок в ref.1 для оригинальной конструкции камеры).
За последние 70 лет этот метод был применен ко многим различным тканям, особенно к кишечной ткани, для изучения транспорта питательных веществ и ионов. Например, механизм диареи, вызванной холерой, был изучен путем установки подвздошной кишки кролика в этих камерах, и было обнаружено, что диарея, вызванная холерой, опосредована цАМФ2. Кроме того, эти камеры также использовались для изучения механизма, лежащего в основе транспорта глюкозы через Na+-глюкозный котранспортер 1 (SGLT1)3. Наша лаборатория фокусируется на трансклеточном и параклеточном транспорте в эпителиальных клетках кишечника. Используя метод камеры Уссинга, транспорт пептидов оценивали у нокаутирующих мышей Claudin 15, у которых нарушен параклеточный транспорт натрия, с использованием камер Ussing для измерения поглощения негидролизуемого дипептида глицилсаркозина. Установлено, что люминальный гомеостаз Na+ важен для протонно-связанного транспорта пептидов4. Кроме того, эти камеры также использовались для исследования секреции аниона в слепой кишке мышей в ответ на подслизистую активацию рецептора протеиназы 1 сериновой протеазой трипсина5.
Камеры Ussing также недавно использовались для оценки параклеточных путей в эпителиальной ткани. Параклеточные пути регулируются плотными соединениями, которые представляют собой комплексы белков, образующихся в точке, где встречаются две или более клетки6. Барьерная функция и селективность ионов (способны ли анионы или катионы избирательно проходить через плотное соединение) определяется наличием белков семейства клаудинов; некоторые из которых действуют как барьеры (клодин 3 и 7), анионные поры (клаудин 10а) или катионные поры (клаудин 2, 10b и 15)7. Другие методы были использованы для оценки параклеточного пути, такие как пероральный прием FITC, сопровождаемый концентрацией FITC в плазме крови ИЛИ EDTA-Cr9; однако эти методы имеют более низкое разрешение и не могут оценить селективность ионов или определенный участок отделов кишечного тракта. Однако камеры ussing могут быть использованы для оценки потенциала разбавления целевых ионов и, следовательно, определения селективности ионов плотных соединений. Например, с NaCl селективность плотных соединений для Na+ и Cl– может быть рассчитана путем разбавления одной стороны мембраны (обычно стороны слизистой оболочки) и измерения изменения разности трансэпителиальных потенциалов. Относительные проницаемости Na+ и Cl– могут быть оценены по уравнению Голдмана-Ходжкина-Каца10, а селективность плотного соединения может быть оценена с помощью уравнения Кимидзука-Кокецу11. Эти камеры, таким образом, имеют преимущество измерения электрофизиологических параметров ткани и в результате предоставляют больше информации о прохождении ионов через плотные соединения, чем другие методы с более низким разрешением.
Метод камеры Юссинга не ограничивается только кишечным трактом, хотя он широко используется в исследованиях, касающихся кишечника, он также имеет много других применений. Например, эти камеры использовались для изучения муковисцидоза и, в частности, трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза хлоридного канала (CFTR)12. Муковисцидоз вызван мутацией CFTR13, которая приводит к нарушению секреции хлоридов и транспорта жидкости дыхательными эпителиальными клетками и, как следствие, более толстому, сухому слизистому слою14. Исследование CFTR эпителия дыхательных путей было проведено с помощью этих камер, чтобы не только понять болезнь, но и найти способы лечения заболевания. Например, у пациентов с редкими мутациями, вызывающими муковисцидоз, анализ респираторных эпителиальных клеток пациента использовался для тестирования таких методов лечения, как Orkambi и усилительная котерапия15.
Камеры Ussing также использовались для изучения путей доставки лекарств, таких как биопсия ткани человека для изучения поглощения лекарств и фармакокинетики16. Кишечное поглощение не является единственным путем доставки лекарств. Эти камеры также использовались для изучения носовых систем доставки лекарств17. Исследования доставки лекарств с камерами Ussing также были выполнены для глаз. В роговице кролика были проведены исследования проницаемости и поглощения с помощью Лабразола, препарата, который предназначен для увеличения абсорбции лекарств через ткани18. В другом исследовании изучалось влияние бензилалкония хлорида на транссклеральную доставку лекарств в склере кролика19.
Метод камеры Ussing полезен, потому что можно использовать нативную ткань. Таким образом, он предпочтительнее моделей in vitro , таких как клеточные линии Caco-2. Тем не менее, метод требует навыков и времени для подготовки образцов, поэтому он не подходит для приложений с высокой пропускной способностью. Электрофизиологические свойства клеточных монослоев могут быть изучены с помощью вставок клеточной культуры в этих камерах. Недавние открытия позволили культивировать органоиды, которые являются мини-органами, выращенными в культуре из извлечения эпителиальных или эндотелиальных стволовых клеток20. Органоидной культурой можно манипулировать, чтобы она была выращена в монослое, что позволяет устанавливать органоиды в камеру Ussing21. Органоиды различных эпителиальных и эндотелиальных тканей могут быть изучены, снижая количество необходимых животных, так как органоидная культура может поддерживаться в течение длительного времени. Это также увеличит пропускную способность, так как трудоемкие и трудоемкие этапы рассечения тканей и подготовки не понадобятся. В будущем камерные исследования Ussing будут по-прежнему очень полезны для изучения транспорта тканей, и они будут особенно важны в области персонализированной медицины.
Следующий протокол демонстрирует применение метода камеры Уссинга для оценки пермселективности и барьерной функции плотных соединений в тонкой кишке нокаутных мышей Claudin 15 (Cldn15-/-) и контроля дикого типа (WT) путем измерения потенциала разбавления NaCl. Плотные соединения (TJ) образуются в точке, где встречаются две или более клетки в эпителиальной и эндотелиальной ткани. Считается, что двухклеточные плотные соединения (bTJ), особенно белки семейства клаудинов, обнаруженные в bTJ, определяют барьерную функцию и пермселективность TJ7. Cldn15-/- мыши имеют мега тонкую кишку22 и сниженную способность поглощения питательных веществ из-за потери кишечной рециркуляции Na+, которая происходит через клаудин 154,23,24. Cldn15-/- мыши имеют нарушенный гомеостаз Na+, что делает их интересной моделью для изучения пермселективности TJ. Следующий протокол оценивает проницаемость TJ к NaCl путем измерения потенциала разбавления NaCl (PNa/PCl) в средней тонкой кишке. Вкратце, изменение разности мембранных потенциалов, которое происходит при разбавлении одной стороны мембраны (сторона M или сторона S, оба измеряются в приведенном ниже протоколе), может быть использовано для расчета проницаемости Na+ (PNa) и Cl– (PCl), а потенциал разрежения (PNa/PCl) покажет, имеет ли плотное соединение катионную или анионную селективность.
Эксперименты по этому протоколу проводились с использованием кастомизированной камеры Ussing (рисунок 1A), которая состоит из двух половин, между которыми вертикально установлен кишечный препарат, усилителя зажима напряжения, электрического регистратора, электродов, солевых мостиков, раствора Рингера, буфера HEPES (150 мМ NaCl), разбавленного буфера HEPES (75 мМ NaCl), кишечной подготовки (подробнее об оборудовании см. в Таблице материалов).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом эксперименте камеры Ussing использовались для измерения исходных электрических параметров и потенциала разбавления NaCl в тонком кишечнике мышей Cldn15-/- и WT. При проведении экспериментов с камерой Уссинга очень важно убедиться, что мембранный препарат, используемый в экспе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается 17K00860 (до HH) и 19K20152 (до NI). WH хотел бы поблагодарить Стипендиальный фонд Оцука Тосими за их финансовую поддержку с 2018 по 2021 год.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
