Протокол, описанный здесь, описывает быстрый и эффективный метод измерения нейтрализующих антител против спайкового белка SARS-CoV-2 путем оценки способности реконвалесцентных образцов сыворотки ингибировать инфекцию усиленным зеленым флуоресцентным белком меченым вирусом везикулярного стоматита, псевдотипизированным с шиповым гликопротеином.
Поскольку пандемия COVID-19, вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), продолжает развиваться, стало очевидно, что наличие нейтрализующих антител против вируса может обеспечить защиту от будущей инфекции. Таким образом, поскольку создание и трансляция эффективных вакцин против COVID-19 продолжается с беспрецедентной скоростью, разработка быстрых и эффективных методов измерения нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 будет становиться все более важной для определения долгосрочной защиты от инфекции как для ранее инфицированных, так и для иммунизированных лиц. В этой статье описывается высокопроизводительный протокол с использованием вируса везикулярного стоматита (VSV), псевдотипизированного с шиповым белком SARS-CoV-2, для измерения наличия нейтрализующих антител в реконвалесцентной сыворотке у пациентов, которые недавно выздоровели от COVID-19. Использование реплицируемого псевдотипного вируса устраняет необходимость в объекте сдерживания уровня 3, необходимом для обработки SARS-CoV-2, что делает этот протокол доступным практически для любой лаборатории уровня сдерживания 2. Использование формата 96 скважин позволяет одновременно запускать множество образцов с коротким временем обработки 24 ч.
В декабре 2019 года был выявлен новый коронавирус, который мы теперь знаем как SARS-CoV-2, возбудитель коронавирусной болезни 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 — бетакоронавирус, принадлежащий к семейству Coronaviridae. Эти вирусы в оболочке содержат большой геном РНК с положительным смыслом и ответственны за респираторные и кишечные инфекции как у людей, так и уживотных2. По состоянию на май 2021 года во всем мире зарегистрировано более 157 миллионов случаев COVID-19 и более 3,2 миллиона смертей3. Разработка эффективной вакцины стала основной целью исследователей по всему миру, по крайней мере, 77 доклинических вакцин находятся в стадии исследования и 90 в настоящее время проходят клинические испытания4.
Коронавирусы кодируют четыре структурных белка, включая спайк-белок (S), нуклеокапсид (N), белок оболочки (E) и мембранный белок (M). Вступление SARS-CoV-2 требует взаимодействия рецептор-связывающего домена (RBD) S с рецептором хозяина, человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) и последующим слиянием мембран после протеолитического расщепления клеточной сериновой протеазой хозяина, трансмембранной протеазой серином 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Гуморальная иммунодоминальность S-белка SARS-CoV была ранее сообщена и теперь показана также для SARS-CoV-211,12,13. Действительно, нейтрализующие реакции антител против S были обнаружены у выздоравливающих сывороток пациентов с SARS-CoV через 24 месяца после заражения14,что подчеркивает их критическую роль в долгосрочном иммунном ответе. Белок S был идентифицирован как перспективная мишень для вакцин и, таким образом, стал ключевым компонентом большинства разрабатываемых вакцин15,16.
Хотя быстрое выявление нейтрализующих антител является критическим аспектом разработки вакцины, оно может также пролить свет на уровень инфицирования и сероэпидемиологический надзор в затронутых районах17. Компетентный к репликации VSV псевдотипизированный с гликопротеином SARS-CoV-2 S вместо гликопротеина VSV дикого типа для изучения инфекции SARS-CoV-2 в условиях биобезопасности уровня 2 был любезно пожертвован Уиланом и его коллегами18. VSV-экспрессирующий спайк (VSV-S) будет использоваться для определения нейтрализующего ответа антител против спайкового белка SARS-CoV-2. Поскольку VSV-S, используемый здесь, также экспрессирует усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), очаги eGFP могут быть обнаружены в течение 24 ч для количественной оценки инфекции, тогда как образование бляшек может занять от 48 до 72 ч. Здесь обобщен простой и эффективный протокол определения способности выздоравливающей сыворотки пациента нейтрализовать инфекцию VSV-S-eGFP. Этот метод также может быть легко адаптирован для опроса других потенциальных терапевтических средств, которые направлены на нарушение взаимодействия хозяина с вирусом белка SARS-CoV-2 S.
Метод, описанный здесь, может быть адаптирован к различным лабораторным средам и ресурсам по мере необходимости. Важно отметить, что основным ограничением этого протокола является необходимость защиты пространства уровня 2 и вытяжки культуры тканей. Применение реплицируемого РНК-вир?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Уилана за щедрое предоставление вируса VSV-S-eGFP, используемого в этом протоколе (описанного в Case et al. 2020). Мы также благодарим докторов Билла Кэмерона и Ютапорна Коуэна (и команду) за сбор образцов крови пациента (идентификатор протокола REB 20200371-01H). Авторы раскрывают получение следующей финансовой поддержки для исследования, авторства и / или публикации этой статьи: Эта работа была профинансирована щедрой поддержкой Фонда больницы Оттавы и грантом от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (#448323) и быстрым грантом от фонда Thistledown для науки о COVID-19 C.S.I. T.R.J. финансируется стипендией для выпускников Онтарио и кластерной стипендией Mitacs. JP финансируется кластерной стипендией Mitacs. T.A. финансируется CIHR Banting Fellowship. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования.
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |