Summary
Het hier beschreven protocol schetst een snelle en effectieve methode voor het meten van neutraliserende antilichamen tegen het SARS-CoV-2 spike-eiwit door het vermogen van herstellende serummonsters te evalueren om infectie te remmen door een verbeterd groen fluorescerend eiwit-gelabeld vesiculaire stomatitisvirus pseudotyped met spike glycoproteïne.
Abstract
Naarmate de COVID-19-pandemie veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) blijft evolueren, is het duidelijk geworden dat de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen tegen het virus bescherming kan bieden tegen toekomstige infecties. Dus, naarmate de creatie en vertaling van effectieve COVID-19-vaccins met een ongekende snelheid doorgaat, zal de ontwikkeling van snelle en effectieve methoden om neutraliserende antilichamen tegen SARS-CoV-2 te meten steeds belangrijker worden om de bescherming op lange termijn tegen infectie te bepalen voor zowel eerder geïnfecteerde als geïmmuniseerde personen. Dit artikel beschrijft een high-throughput protocol met behulp van vesiculaire stomatitis virus (VSV) pseudotyped met het SARS-CoV-2 spike-eiwit om de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen in herstellend serum te meten van patiënten die onlangs zijn hersteld van COVID-19. Het gebruik van een replicerend pseudotyped virus elimineert de noodzaak voor een containment level 3-faciliteit die nodig is voor SARS-CoV-2-behandeling, waardoor dit protocol toegankelijk is voor vrijwel elk containment level 2-lab. Het gebruik van een 96-well formaat maakt het mogelijk om veel samples tegelijkertijd uit te voeren met een korte doorlooptijd van 24 uur.
Introduction
In december 2019 werd een nieuw coronavirus geïdentificeerd, dat we nu kennen als SARS-CoV-2, de veroorzaker van coronavirusziekte 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 is een betacoronavirus dat behoort tot de familie Coronaviridae. Deze omhulde virussen bestaan uit een groot positief-zintuigig RNA-genoom en zijn verantwoordelijk voor luchtweg- en darminfecties bij zowel mens als dier2. Vanaf mei 2021 zijn er wereldwijd meer dan 157 miljoen gemelde gevallen van COVID-19 en meer dan 3,2 miljoen sterfgevallen3. De ontwikkeling van een effectief vaccin is het primaire doel geworden van onderzoekers over de hele wereld met ten minste 77 preklinische vaccins die worden onderzocht en 90 die momenteel klinische proeven ondergaan4.
Coronavirussen coderen voor vier structurele eiwitten, waaronder het spike-eiwit (S), nucleocapsid (N), envelope-eiwit (E) en het membraaneiwit (M). Binnenkomst van SARS-CoV-2 vereist interactie van het receptorbindende domein (RBD) van S met de gastheerreceptor, humaan angiotensine-converterend enzym 2 (hACE2) en daaropvolgende membraanfusie na proteolytische splitsing door gastheercellulair serineprotease, transmembraanprotease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humorale immunodominantie van het S-eiwit van SARS-CoV is eerder gemeld en is nu ook aangetoond voor SARS-CoV-211,12,13. Inderdaad, neutraliserende antilichaamresponsen tegen S zijn gedetecteerd in herstellend serum van SARS-CoV-patiënten 24 maanden na infectie14, wat hun kritieke rol in de immuunrespons op lange termijn benadrukt. Het S-eiwit is geïdentificeerd als een veelbelovend vaccindoel en is dus een belangrijk onderdeel geworden van de meeste vaccins in ontwikkeling15,16.
Hoewel de snelle detectie van neutraliserende antilichamen een cruciaal aspect is van de ontwikkeling van vaccins, kan het ook licht werpen op de snelheid van infectie en sero-epidemiologische surveillance in getroffen gebieden17. Een replicatie-competente VSV pseudotype met het SARS-CoV-2 S glycoproteïne, in plaats van het wild-type VSV glycoproteïne, om SARS-CoV-2 infectie in bioveiligheidsniveau 2 instellingen te bestuderen, werd vriendelijk gedoneerd door Whelan en collega's18. VSV expressing spike (VSV-S) zal worden gebruikt om de neutraliserende antilichaamrespons tegen SARS-CoV-2 spike-eiwit te bepalen. Omdat de VSV-S die hier wordt gebruikt ook verrijkt groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengt, kunnen eGFP-foci binnen 24 uur worden gedetecteerd om infectie te kwantificeren, terwijl plaquevorming 48 tot 72 uur kan duren. Hier samengevat is een eenvoudig en effectief protocol om het vermogen van herstellend patiëntenserum te bepalen om VSV-S-eGFP-infectie te neutraliseren. Deze methode kan ook gemakkelijk worden aangepast om andere potentiële therapieën te ondervragen die gericht zijn op het verstoren van de gastheer-virale interactie van SARS-CoV-2 S-eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating cellen (Dag 1) voor de productie en kwantificering van SARS-CoV-2 pseudovirus
- Voorbereiding op weefselkweek
- Warm 1x Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% Foetaal Runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (optioneel); en 0,25% trypsine-ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) tot 37 °C in een waterbad gedurende ongeveer 15 minuten.
- Desinfecteer een weefselkweekkap met 70% ethanol en plaats indien nodig weefselkweekschalen, Pasteur-pipetten en serologische pipetten in de weefselkweekkap. Verwijder PBS, DMEM en trypsine uit het waterbad en desinfecteer met 70% ethanol voordat u het in de weefselkweekkap plaatst.
- Plating en onderhoud van cellen
- Kweek Vero E6-cellen in DMEM (met 10% FBS) in T75 weefselkweekkolven of 15 cm weefselkweekschalen in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Doorloop de cellen indien nodig wanneer cellen 80-90% confluent zijn.
- Was de cellen door 10 ml 1x PBS aan elke schaal toe te voegen en 4-5 keer zachtjes te schommelen; aspirateer de PBS. Voeg 3 ml trypsine-EDTA toe aan elk gerecht, rock de plaat om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak bedekt is. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende ongeveer 5 minuten, of totdat de cellen zich hebben losgemaakt.
- Voeg 7 ml DMEM (met 10% FBS) toe om het trypsine te deactiveren en resuspend de cellen door meerdere keren op en neer te pipetteren. Draai de cellen naar beneden om het trypsine te verwijderen met behulp van een benchtopcentrifuge bij 500 × g gedurende 5 minuten, adem de media op zonder de celkorrel te verstoren en resuspend de cellen in 10 ml DMEM (met 10% FBS). Als cellen nodig zijn voor toekomstige experimenten, plaats dan 1 ml in een nieuwe schaal met 15 ml verse DMEM (met 10% FBS).
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer en voeg ongeveer 1 × 107 cellen toe aan elke plaat van 15 cm en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 totdat ze 100% confluent zijn (1-2 dagen).
2. VSV-S-EGFP pseudoviruspreparaat
- Infectie
- Infecteer cellen bij multipliciteit van infectie (MOI) 0,01 met VSV-S-eGFP stockvirus in 12 ml serumvrije DMEM gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2, af en toe schommelend op de platen. Vervang het entmateriaal door verse DMEM (met 2% FBS en 20 mM HEPES, pH 7,7) en ga naar een incubator die is ingesteld op 34 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Een temperatuur van 34 °C is vereist voor de vermeerdering van VSV-S-eGFP in celkweek. - Verzamel celsupernatanten na observatie van uitgebreid cytopathisch effect (CPE) en celdetachement, ongeveer 48 uur na infectie. Gebruik een fluorescerende microscoop om de uitgebreide expressie van eGFP door geïnfecteerde cellen te visualiseren vanaf 24 uur na infectie.
- Infecteer cellen bij multipliciteit van infectie (MOI) 0,01 met VSV-S-eGFP stockvirus in 12 ml serumvrije DMEM gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2, af en toe schommelend op de platen. Vervang het entmateriaal door verse DMEM (met 2% FBS en 20 mM HEPES, pH 7,7) en ga naar een incubator die is ingesteld op 34 °C met 5% CO2.
- Collectie
- Centrifugeer de supernatanten met behulp van een tafelcentrifuge gedurende 5 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C om het celafval te verwijderen. Gebruik het supernatant om meerdere vries-dooicycli te voorkomen en bewaar bij -80 °C.
3. Titering van het VSV-S-eGFP pseudovirus
- Seriële verdunning om virale titer te bepalen
- Plate Vero E6 cellen op 6-well platen met een zaaidichtheid van 6 × 105 cellen per put in DMEM (met 10% FBS), en 's nachts incuberen bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Vero-cellen die TMPRSS2 en hACE2 overexpressie hebben, kunnen ook worden gebruikt. - Stel een 10-voudige seriële verdunningsreeks van het VSV-S-eGFP-virus in koude serumvrije DMEM in door 900 μL media in zeven microcentrifugebuizen te plaatsen. Label buizen van 1 tot 7. Voeg 100 μL van de virale voorraad toe aan de eerste buis en vortex kort. Breng 100 μL verdund virus over van buis 1 naar buis 2 en vortex kort; ga door tot buis 7.
- Aspirateer het medium uit alle putten van de 6-putplaat met Vero E6-cellen en vervang door 500 μL verdunningen 10-2 tot 10-7. Incubeer de platen gedurende 45 minuten bij 37 °C met 5% CO2,zachtjes schommelend om de 15 minuten.
- Aspirateer het entmateriaal en vervang door een overlay met een 1:1 mengsel van 2x DMEM en 6% carboxymethylcellulose (CMC), eindconcentratie van 3% CMC, aangevuld met 10% FBS; incubeer bij 34 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
OPMERKING: Verwarm het overlaymengsel gedurende 15 minuten tijdens de infectiestap voor in een waterbad van 37 °C. Een 1:1 mengsel van 1% agarose met 2x DMEM aangevuld met 10% FBS kan worden gebruikt in plaats van CMC. Om te bedekken met agarose, kook 1% agarose (in dH2O) en meng met koude 2x DMEM. Zorg ervoor dat het mengsel een geschikte temperatuur heeft voordat u het toevoegt aan de celmonolaag (ongeveer 37-40 °C). Als agarose wordt gebruikt voor de overlay, moeten cellen worden gefixeerd door te incuberen in 2 ml 3:1 methanol:azijnzuur gedurende ten minste één uur voorafgaand aan de kleuring.
- Plate Vero E6 cellen op 6-well platen met een zaaidichtheid van 6 × 105 cellen per put in DMEM (met 10% FBS), en 's nachts incuberen bij 37 °C met 5% CO2.
- Kleuring en berekening virale titer
- Visualiseer plaques door te kleuren met kristalviolet of directe visualisatie van eGFP onder een fluorescerende microscoop.
- Om platen te beitsen, aspirateer de overlay, was eenmaal met PBS en voeg vervolgens 2 ml 0,1% kristalviolet (in 80% methanol en dH2O) toe aan elke put. Plaats op een plaatwip gedurende ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u de kleuring verwijdert. Verwijder het kristalviolet en was elke put twee keer voorzichtig met dH2O of PBS.
OPMERKING: Was- en kleuringsstappen moeten voorzichtig worden uitgevoerd door langzaam naar de zijkant van elke put te pipetteren om ervoor te zorgen dat de celmonolaag intact blijft tijdens de procedure. - Laat de platen minstens 1 uur drogen voordat u de plaques telt. Zorg ervoor dat plaquetellingen worden verkregen uit putten met 20 tot 200 plaques. Om de titer van het virus in plaquevormende eenheden (PFU) per ml te berekenen, vermenigvuldigt u de verdunningsfactor van de getelde put met het infectievolume en deelt u dit aantal uit de plaques die in de respectieve put aanwezig zijn.
4. Platingcellen (dag 1) voor de meting van de neutralisatie van SARS-CoV-2 pseudovirus door in de handel verkrijgbare antilichamen en herstellende patiëntserum
- Voorbereiding op weefselkweek
- Bereid medium- en weefselkweekkap voor zoals beschreven in rubriek 1. Bereid bovendien het benodigde aantal van 96 putplaten voor op minimaal 2 replicaties per monster (d.w.z. 1 plaat per 6 monsters); voeg extra replicaties toe als het monstervolume dit toelaat.
- Plating en onderhoud van cellen
- Vero E6-cellen laten groeien en onderhouden zoals beschreven in rubriek 1. Bereid ten minste 10 ml celsuspensie per 96-putplaat in een concentratie van 2 × 105 cellen per ml (plaat 1,5 × 105 cellen per ml voor testen die na 48 uur worden uitgevoerd, indien nodig). Voeg 100 μL celsuspensie toe aan elke put van een 96-putplaat met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Meng de celsuspensie goed en schommel elke plaat zachtjes in alle richtingen om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen.
- Vero E6-cellen laten groeien en onderhouden zoals beschreven in rubriek 1. Bereid ten minste 10 ml celsuspensie per 96-putplaat in een concentratie van 2 × 105 cellen per ml (plaat 1,5 × 105 cellen per ml voor testen die na 48 uur worden uitgevoerd, indien nodig). Voeg 100 μL celsuspensie toe aan elke put van een 96-putplaat met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
5. Antilichaam- of serumverdunningen en infecties (dag 2)
OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast om de neutralisatie van VSV-S-eGFP te meten door zowel in de handel verkrijgbare antilichamen en patiëntenserum, als serum verzameld van dieren voor preklinische vaccinontwikkelingsstudies. *Let op de aanvullende stappen die worden vermeld bij het hanteren van serummonsters van patiënten/dieren.
- Serie seriële verdunning
- Voordat serummonsters worden verdund, inactiveer je elk monster gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 °C om het complement te inactiveren. Ervoor zorgen dat de nodige veiligheidsmaatregelen worden genomen bij het hanteren van patiëntmonsters; open alleen monstercontainers wanneer deze zich in de weefselkweekkap bevinden en zorg ervoor dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen van insluitingsniveau 2 worden gedragen.
- Zet de verdunningsreeks in een lege 96-well plaat (Plaat 1).
- Begin alle verdunningen in rij A van de 96-putplaat in 80 μL. *Voor patiëntmonsters begint u de verdunningsreeks bij 1 op 10 door 8 μL serum in 72 μL serumvrije DMEM te plaatsen (met 1% penicilline/streptomycine).
OPMERKING: De gebruikte concentratie neutraliserend antilichaam is afhankelijk van de door de fabrikant voorspelde activiteit. Voor het SARS-CoV-2 Spike-neutraliserende antilichaam dat hier wordt gebruikt (zie de tabel met materialen),begin met 5 μg / ml om ten minste 50% neutralisatie te observeren. - Voeg 40 μL serumvrije DMEM (met 1% penicilline/streptomycine) toe aan de rijen B tot en met G en 80 μL aan rij H. Voeg geen virus toe aan rij H, omdat het dient als een controle voor alleen cellen.
- Gebruik een 12-well meerkanaals pipet, meng en breng 40 μL verdund serum of antilichaam over van rij A naar rij B. Meng en herhaal tot rij F, gooi 40 μL van rij F weg. Voeg geen serum toe aan rij G, omdat dit de viruscontrolerij vertegenwoordigt.
- Infectie en overlay
- Bereid een geschikt volume verdunde VSV-S-eGFP om elke put te behandelen met MOI 0,05 (of 2000 pfu). (Houd er bij het voltooien van deze berekening rekening mee dat slechts 60 μL van het totale volume van 80 μL naar de cellen wordt verplaatst; zorg er daarom voor dat u het volume van het virus met 1,33 vermenigvuldigt om 2000 pfu te behouden).
OPMERKING: Aangezien VSV-S-eGFP temperatuurgevoelig is, moet u ervoor zorgen dat virale voorraden op ijs blijven wanneer ze niet in gebruik zijn en meerdere vries-dooicycli vermijden, omdat titers zullen verschillen na herhaalde bevriezing. - Voeg 40 μL verdund virus toe aan elke put in rijen A tot G van plaat 1 en meng door 4-5 keer op en neer te pipetteren. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2.
- Verwijder de plaat met cellen uit de incubator (plaat 2) en aspirateer de media voorzichtig uit alle putten. Breng 60 μL antilichaam/virusmengsel over van plaat 1 naar plaat 2 en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2,waarbij de plaat om de 20 minuten wordt gewisd.
- Vul elke put aan met 140 μL overlay met CMC in DMEM voor een uiteindelijke concentratie van 3% CMC (met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine). Plaats plaat 2 in een couveuse die is ingesteld op 34 °C met 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur vóór de beeldvorming.
OPMERKING: Verwarm het overlaymengsel gedurende 15 minuten tijdens de infectiestap voor in een waterbad van 37 °C.
- Bereid een geschikt volume verdunde VSV-S-eGFP om elke put te behandelen met MOI 0,05 (of 2000 pfu). (Houd er bij het voltooien van deze berekening rekening mee dat slechts 60 μL van het totale volume van 80 μL naar de cellen wordt verplaatst; zorg er daarom voor dat u het volume van het virus met 1,33 vermenigvuldigt om 2000 pfu te behouden).
6. Beeldvorming en kwantificering (dag 3)
- Beeldplaten met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende imager (met behulp van een fluoresceïne-isothiocyanaatfilter (FITC) of een alternatief filter met een excitatiegolflengte van 488 nm). Kwantificeer virale infectie door een protocol te maken dat automatisch individuele eGFP-foci identificeert en telt. Als er geen automatische telfunctie beschikbaar is, gebruikt u ImageJ-software om het aantal eGFP-foci te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol schetst een snelle en effectieve methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen tegen SARS-CoV-2 S-eiwit via remming van VSV-S-eGFP pseudovirusinfectie (kwantificeerbaar door verlies van gedetecteerde eGFP-foci). Een schematische weergave van het protocol is weergegeven in figuur 1. Het wordt aanbevolen om een in de handel verkrijgbaar antilichaam te gebruiken als een positieve controle telkens wanneer de test wordt uitgevoerd om de consistentie van de test te waarborgen. Hier demonstreren we een verdunningscurve met behulp van een in de handel verkrijgbaar neutraliserend IgG-antilichaam tegen SARS-CoV-2 Spike RBD in vergelijking met een IgG-controle (zie de tabel met materialen voor details over beide antilichamen; Figuur 2).
Herstellende patiëntmonsters werden ongeveer drie maanden na SARS-CoV-2-infectie verzameld en pseudovirusneutralisatie werd bepaald met behulp van de hierboven beschreven methode(figuur 3). Belangrijk is dat minimale achtergrondremming werd waargenomen met behulp van gezond donorserum. Bovendien maakt deze test onderscheid tussen patiënten met een hoge ernst van de symptomen versus patiënten met een mildere ziekte op basis van de noodzaak van ziekenhuisopname. In lijn met andere rapporten hebben we binnen ons kleine cohort waargenomen dat gehospitaliseerde patiënten de neiging hebben om een verhoogde neutraliserende capaciteit te vertonen dan degenen die geen ziekenhuisopname nodig hadden19,20. Hoewel dit niet altijd het geval is voor gehospitaliseerde versus niet-gehospitaliseerde patiëntenmonsters, is het vermogen van de test om verschillende gradaties van neutralisatie te onderscheiden een troef. Er kunnen ook gevallen zijn waarin het neutraliserende vermogen van het serum van de patiënt veel hoger is dan die hier worden aangetoond. Indien nodig kan de startverdunning van het serum van de patiënt worden aangepast of kunnen aanvullende verdunningsstappen worden uitgevoerd op een extra plaat.
Figuur 1: Protocoloverzicht dat neutralisatie van VSV-S-eGFP door herstellend serum aantoont. Afkortingen: VSV = vesiculaire stomatitis virus; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; COVID-19 = coronavirusziekte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een in de handel verkrijgbaar neutraliserend antilichaam tegen SARS-CoV-2 is gebruikt als voorbeeld van een positieve controle naast IgG als negatieve controle. Het vermogen van neutraliserende antilichamen om virale infectie te remmen zal variëren; raadpleeg de beschikbare informatie voor het specifieke antilichaam dat is gekocht om te bepalen in welke concentratie de verdunningscurve moet beginnen (monsters werden in drievoud uitgevoerd, foutstaven vertegenwoordigen ± SD). (A) Procentuele remming is berekend op basis van het aantal eGFP-foci gedetecteerd via (B) fluorescerende beeldvorming. Afkortingen: SARS-CoV-2 = severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; IgG = immunoglobuline; SD = standaarddeviatie; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; RBD = receptor-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het vermogen van herstellend serum van patiënten om VSV-S-eGFP te neutraliseren varieert afhankelijk van de ernst van de symptomen. Serummonsters van patiënten werden ongeveer 3 maanden na sars-cov-2-infectie verzameld en controlemonsters werden verzameld van niet-geïnfecteerde patiënten (monsters werden in drievoud uitgevoerd, foutbalken vertegenwoordigen ± SD). (A) Procentuele remming is berekend op basis van het aantal eGFP-foci gedetecteerd via (B) fluorescerende beeldvorming. Afkortingen: SARS-CoV-2 = severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SD = standaarddeviatie; eGFP = versterkt groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode kan indien nodig worden aangepast aan verschillende laboratoriumomgevingen en -middelen. Belangrijk is dat de belangrijkste beperking van dit protocol de noodzaak is voor een containment niveau 2 ruimte en weefselkweekkap. De toepassing van een replicerend RNA-virus pseudotypeerd met de SARS-CoV-2-piek, zoals VSV-S-eGFP, is een formidabel alternatief voor het SARS-CoV-2-virus, dat een inperkingsniveau 3-werkgebied vereist, maar voor sommige groepen een beperking kan blijven. Alle andere stappen die hier worden beschreven, zijn vrij flexibel en kunnen in bijna elk laboratorium van containmentniveau 2 worden uitgevoerd. Het gebruik van een fluorescerende imager met een geautomatiseerde telfunctie is bijvoorbeeld niet nodig. Het 96-well-formaat dat hier wordt gebruikt, betekent dat er slechts ongeveer 4 gezichtsvelden nodig zijn om bijna de hele put in beeld te brengen met behulp van het laagste beschikbare objectief (2x).
Een handmatige fluorescerende microscoop kan worden gebruikt om meerdere velden van elke put in beeld te geven, en ImageJ (vrije software) kan vervolgens worden gebruikt om eGFP-foci te kwantificeren. Bovendien hebben we ervoor gekozen om het 96-well-formaat te gebruiken om het laagst mogelijke serumvolume te gebruiken en het verbruik van verbruiksartikelen tot een minimum te beperken. Als een fluorescerende microscoop niet beschikbaar is, kan dit protocol worden opgeschaald naar een 6- of 12-well-formaat om plaquevorming te detecteren na kristalvioletfixatie en kleuring (vergelijkbaar met het virale titerprotocol dat hierboven is beschreven). De meest kritische overweging om in gedachten te houden bij het uitvoeren van dit protocol is de temperatuurgevoeligheid van VSV-S-eGFP. Wanneer u met VSV-S-eGFP werkt, moet u het virus altijd in kleine volumes verwerken om meerdere vries-dooicycli te voorkomen en het virus waar mogelijk in de ijskast te houden. Bovendien kan een robuust fluorescerend signaal na 24 uur worden gedetecteerd; we hebben echter vergelijkbare resultaten verkregen na beeldvorming 20 tot 28 uur na infectie.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de aanwezigheid van antilichamen tegen SARS-CoV-2 te detecteren, waaronder de gouden standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assay, die de totale hoeveelheid antilichamen tegen S21,22kwantificeert. Hier hebben we een snelle en betrouwbare methode geschetst om specifiek neutraliserende antilichamen tegen het immunodominante SARS-CoV-2 spike-eiwit in herstellend serum van patiënten te detecteren. We hebben de klassieke plaque-reductie neutralisatietest (PRNT) verbeterd door zich met succes aan te passen aan een 96-well-formaat, waardoor neutraliserende antilichamen in een groot aantal monsters binnen 24 uur kunnen worden gedetecteerd door geautomatiseerde kwantificering van pseudovirusinfectie, waardoor een snelle doorlooptijd van definitieve gegevensrapporten mogelijk is. Naast het detecteren van neutraliserende antilichamen in serum, kan deze methode worden aangepast om high-throughput screening van andere therapeutische strategieën uit te voeren, die gericht zijn op het direct remmen van de SARS-CoV-2 spike-eiwitinteractie met hACE2, zoals monoklonale antilichamen, recombinant oplosbaar hACE2 of proteaseremmers, om virale toegang te belemmeren23 . Met de opkomst van verschillende SARS-CoV-2 spike-eiwitvarianten, is het ook belangrijk op te merken dat deze methode kan worden toegepast om te bepalen of vergelijkbare neutralisatieniveaus optreden na infectie met verschillende varianten van het virus24.
Andere voorbeelden van beschikbare methoden om antilichamen tegen SARS-CoV-2 te detecteren, zijn ELISA's, op lentivirus gebaseerde testen en commerciële kits om de neutraliserende capaciteit van serummonsters te evalueren. Hoewel de veelgebruikte IgM- of IgG-bindende ELISA's een effectieve methode zijn om de aanwezigheid van antilichaamconcentratie te bepalen om eerdere infectie of immunisatie te volgen, zijn ze niet in staat om de neutraliserende capaciteit van de bindende antilichamen te onderscheiden25. Pseudotyped lentivirus-gebaseerde neutralisatietests hebben een verbeterd veiligheidsprofiel, door niet-repliceerbare virale deeltjes te gebruiken in tegenstelling tot het repliceren van VSV-S-eGFP; dit creëert echter een barrière in termen van testcapaciteit, omdat lentivirale titers de neiging hebben om veel lager te zijn26,27. Er zijn verschillende in de handel verkrijgbare kits die het vermogen van antilichamen meten om infectie te blokkeren via competitieve remming van het SARS-CoV-2 spike-eiwit (specifiek RBD) dat zich bindt met de hACE2-receptor na incubatie met herstellend serum (bijv. CUSABIO, GenScript, Abnova). Hoewel veel van deze kits een gerenommeerde gevoeligheid en specificiteit hebben, zijn ze ook relatief duur en daarom niet ideaal voor een groot aantal monsters. Het protocol dat hier wordt aangeboden, is snel, betrouwbaar en goedkoop. Deze high-throughput methode kan worden gebruikt om veel monsters te testen, waarbij binnen 24 uur een robuuste uitlezing wordt bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen met betrekking tot deze publicatie.
Acknowledgments
We willen het Whelan-lab bedanken voor het genereus leveren van het VSV-S-eGFP-virus dat in dit protocol wordt gebruikt (beschreven in Case et al. 2020). We bedanken ook Drs. Bill Cameron en Juthaporn Cowan (en team) voor het verzamelen van de bloedmonsters van de patiënt (REB-protocol ID 20200371-01H). De auteurs onthullen de ontvangst van de volgende financiële steun voor het onderzoek, auteurschap en / of publicatie van dit artikel: Dit werk werd gefinancierd door de genereuze steun van de Ottawa Hospital Foundation en een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (# 448323) en een Fast Grant van de Thistledown Foundation for COVID-19 Science aan C.S.I. T.R.J. wordt gefinancierd door een Ontario Graduate Scholarship en cluster Mitacs fellowship. JP wordt gefinancierd door een cluster Mitacs fellowship. T.A. wordt gefinancierd door een CIHR Banting Fellowship. We willen ook alle personen bedanken die hebben deelgenomen en hun bloedmonsters hebben gedoneerd voor deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L.
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A.
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
- Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F.
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T.
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
