Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus
Summary
O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.
Abstract
À medida que a pandemia COVID-19 causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) continua a evoluir, tornou-se evidente que a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus pode fornecer proteção contra infecções futuras. Assim, à medida que a criação e tradução de vacinas eficazes COVID-19 continua em uma velocidade sem precedentes, o desenvolvimento de métodos rápidos e eficazes para medir anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 se tornará cada vez mais importante para determinar a proteção a longo prazo contra infecções para indivíduos previamente infectados e imunizados. Este artigo descreve um protocolo de alto rendimento usando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína de pico SARS-CoV-2 para medir a presença de anticorpos neutralizantes em soro convalescente de pacientes que se recuperaram recentemente do COVID-19. O uso de um vírus pseudotipado replicante elimina a necessidade de uma instalação de nível 3 de contenção necessária para o manuseio sars-cov-2, tornando este protocolo acessível a praticamente qualquer laboratório nível de contenção 2. O uso de um formato de 96 poços permite que muitas amostras sejam executadas ao mesmo tempo com um curto tempo de retorno de 24 horas.
Introduction
Em dezembro de 2019, foi identificado um novo coronavírus, que hoje conhecemos como SARS-CoV-2, o agente causador da doença coronavírus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 é um betacoronavírus pertencente à família Coronaviridae. Esses vírus envoltos compreendem um genoma de RNA de grande senso positivo e são responsáveis por infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais2. Até maio de 2021, foram registrados mais de 157 milhões de casos notificados de COVID-19 globalmente e mais de 3,2 milhões de mortes3. O desenvolvimento de uma vacina eficaz tornou-se o objetivo principal de pesquisadores em todo o mundo com pelo menos 77 vacinas pré-clínicas sob investigação e 90 atualmente submetidas a testes clínicos4.
Coronavírus codificam quatro proteínas estruturais, incluindo a proteína do pico (S), nucleocapsid (N), proteína envelope (E) e a proteína da membrana (M). A entrada do SARS-CoV-2 requer interação do domínio receptor-vinculativo (RBD) de S com o receptor hospedeiro, enzima conversor de angiotensina humana 2 (hACE2), e posterior fusão de membrana seguindo o decote proteolítico por serina hospedeira, soro de protease transmembrana 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . A imunodominância humoral da proteína S do SARS-CoV foi relatada anteriormente e agora foi mostrada também para SARS-CoV-211,12,13. De fato, as respostas neutralizantes de anticorpos contra S foram detectadas em soro convalescente de pacientes sars-cov 24 meses após a infecção14, destacando seu papel crítico na resposta imune a longo prazo. A proteína S foi identificada como um alvo vacinal promissor e, portanto, tornou-se um componente-chave da maioria das vacinas em desenvolvimento15,16.
Embora a rápida detecção de anticorpos neutralizantes seja um aspecto crítico do desenvolvimento de vacinas, também pode lançar luz sobre a taxa de infecção e vigilância soro-epidemiológica nas áreas impactadas17. Um pseudotipado VSV competente para replicação com a glicoproteína SARS-CoV-2 S, no lugar da glicoproteína VSV do tipo selvagem, para estudar a infecção pelo SARS-CoV-2 em configurações de biossegurança nível 2 foi gentilmente doada por Whelan e colegas de trabalho18. O pico de expressão VSV (VSV-S) será utilizado para determinar a resposta neutralizante de anticorpos contra a proteína de pico SARS-CoV-2. Como o VSV-S usado aqui também expressa proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), os focos eGFP podem ser detectados dentro de 24 horas para quantificar a infecção, enquanto a formação de placas pode levar de 48 a 72 h. Resumido aqui está um protocolo simples e eficaz para determinar a capacidade do soro convalescente do paciente de neutralizar a infecção vsv-S-eGFP. Este método também pode ser facilmente adaptado para interrogar outras terapêuticas potenciais que visam interromper a interação hosmá-viral da proteína SARS-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui descrito pode ser adaptado para atender a diferentes ambientes e recursos de laboratório, conforme necessário. É importante ressaltar que a principal limitação deste protocolo é a necessidade de um espaço de contenção nível 2 e uma capa de cultura tecidual. A aplicação de um vírus RNA replicante pseudotipado com o pico SARS-CoV-2, como VSV-S-eGFP, é uma alternativa formidável ao vírus SARS-CoV-2, que requer uma área de trabalho nível 3 de contenção, mas pode permanecer uma limitação p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao laboratório Whelan por fornecer generosamente o vírus VSV-S-eGFP usado neste protocolo (descrito no Case et al. 2020). Agradecemos também aos Drs. Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e equipe) pela coleta das amostras de sangue do paciente (ID do protocolo REB 20200371-01H). Os autores divulgam o recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: Este trabalho foi financiado pelo generoso apoio da Fundação Hospitalar de Ottawa e uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (#448323) e uma Bolsa Rápida da Fundação Thistledown para a Ciência COVID-19 para c.S.I. T.R.J. é financiada por uma bolsa de pós-graduação de Ontário e uma bolsa mitacs de cluster. JP é financiado por uma bolsa mitacs cluster. A T.A. é financiada por uma Cihr Banting Fellowship. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
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