Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus
Summary
El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.
Abstract
A medida que la pandemia de COVID-19 causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) continúa evolucionando, se ha hecho evidente que la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus puede proporcionar protección contra futuras infecciones. Por lo tanto, a medida que la creación y traducción de vacunas efectivas contra la COVID-19 continúe a una velocidad sin precedentes, el desarrollo de métodos rápidos y efectivos para medir los anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 será cada vez más importante para determinar la protección a largo plazo contra la infección tanto para las personas previamente infectadas como para las inmunizadas. Este artículo describe un protocolo de alto rendimiento que utiliza el virus de la estomatitis vesicular (VSV) pseudotipado con la proteína espiga del SARS-CoV-2 para medir la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero convaleciente de pacientes que se han recuperado recientemente de COVID-19. El uso de un virus pseudotipado replicante elimina la necesidad de una instalación de contención de nivel 3 requerida para el manejo del SARS-CoV-2, lo que hace que este protocolo sea accesible para prácticamente cualquier laboratorio de contención de nivel 2. El uso de un formato de 96 pozos permite ejecutar muchas muestras al mismo tiempo con un corto tiempo de respuesta de 24 h.
Introduction
En diciembre de 2019, se identificó un nuevo coronavirus, que ahora conocemos como SARS-CoV-2, el agente causal de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)1. El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus perteneciente a la familia Coronaviridae. Estos virus envueltos comprenden un gran genoma de ARN de sentido positivo y son responsables de infecciones respiratorias e intestinales tanto en humanos como en animales2. Hasta mayo de 2021 se han reportado más de 157 millones de casos de COVID-19 en todo el mundo y más de 3.2 millones de muertes3. El desarrollo de una vacuna eficaz se ha convertido en el objetivo principal de los investigadores de todo el mundo con al menos 77 vacunas preclínicas bajo investigación y 90 actualmente en fase de ensayos clínicos4.
Los coronavirus codifican cuatro proteínas estructurales, incluida la proteína espiga (S), la nucleocápside (N), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de membrana (M). La entrada del SARS-CoV-2 requiere la interacción del dominio de unión al receptor (RBD) de S con el receptor del huésped, la enzima convertidor de angiotensina humana 2 (hACE2) y la posterior fusión de la membrana después de la escisión proteolítica por la serina proteasa celular del huésped, la serina serina 2 de la proteasa transmembrana (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . La inmunodominancia humoral de la proteína S del SARS-CoV se ha informado previamente y ahora se ha demostrado también para el SARS-CoV-211,12,13. De hecho, se han detectado respuestas de anticuerpos neutralizantes contra S en suero convaleciente de pacientes con SARS-CoV 24 meses después de la infección14,destacando su papel crítico en la respuesta inmune a largo plazo. La proteína S ha sido identificada como un objetivo prometedor de la vacuna y, por lo tanto, se ha convertido en un componente clave de la mayoría de las vacunas en desarrollo15,16.
Si bien la detección rápida de anticuerpos neutralizantes es un aspecto crítico del desarrollo de vacunas, también puede arrojar luz sobre la tasa de infección y la vigilancia seroepidemiológica en las áreas afectadas17. Whelan y sus compañeros de trabajodonaronamablemente un vsV de tipo salvaje pseudotipado con la glicoproteína SARS-CoV-2 S, en lugar de la glicoproteína VSV de tipo salvaje, para estudiar la infección por SARS-CoV-2 en entornos de nivel 2 de bioseguridad 2. El pico de expresión de VSV (VSV-S) se utilizará para determinar la respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2. Como el VSV-S utilizado aquí también expresa proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), los focos de eGFP pueden detectarse dentro de las 24 h para cuantificar la infección, mientras que la formación de placa puede tardar de 48 a 72 h. Aquí se resume un protocolo simple y efectivo para determinar la capacidad del suero del paciente convaleciente para neutralizar la infección por VSV-S-eGFP. Este método también se puede adaptar fácilmente para interrogar otras terapias potenciales que tienen como objetivo interrumpir la interacción huésped-viral de la proteína SARS-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí puede adaptarse para adaptarse a diferentes entornos y recursos de laboratorio según sea necesario. Es importante destacar que la principal limitación de este protocolo es la necesidad de un espacio de contención de nivel 2 y una campana de cultivo de tejidos. La aplicación de un virus de ARN replicante pseudotipado con el pico del SARS-CoV-2, como el VSV-S-eGFP, es una alternativa formidable al virus SARS-CoV-2, que requiere un área de trabajo de nivel 3 de contención, pero puede seguir s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al laboratorio Whelan por proporcionar generosamente el virus VSV-S-eGFP utilizado en este protocolo (descrito en Case et al. 2020). También agradecemos a los dres. Bill Cameron y Juthaporn Cowan (y al equipo) por recolectar las muestras de sangre del paciente (ID de protocolo REB 20200371-01H). Los autores revelan la recepción del siguiente apoyo financiero para la investigación, autoría y / o publicación de este artículo: Este trabajo fue financiado por el generoso apoyo de la Fundación del Hospital de Ottawa y una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (# 448323) y una subvención rápida de la Fundación Thistledown para la Ciencia COVID-19 a C.S.I. T.R.J. está financiada por una beca de posgrado de Ontario y una beca Mitacs del clúster. JP está financiado por una beca Mitacs del clúster. T.A. está financiado por una beca de banting del CIHR. También nos gustaría agradecer a todas las personas que participaron y donaron sus muestras de sangre para este estudio.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
