Påvisning av SARS-CoV-2 Nøytraliserende antistoffer ved bruk av fluorescerende avbildning av pseudovirusinfeksjon med høy gjennomstrømning
Summary
Protokollen som er beskrevet her skisserer en rask og effektiv metode for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 spike protein ved å evaluere evnen til rekonvalesent serumprøver for å hemme infeksjon av et forbedret grønt fluorescerende proteinmerket vesikulær stomatittvirus pseudotyped med spike glykoprotein.
Abstract
Ettersom COVID-19-pandemien forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsetter å utvikle seg, har det blitt tydelig at tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer mot viruset kan gi beskyttelse mot fremtidig infeksjon. Således, etter hvert som opprettelsen og oversettelsen av effektive COVID-19-vaksiner fortsetter med en enestående hastighet, vil utviklingen av raske og effektive metoder for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 bli stadig viktigere for å bestemme langsiktig beskyttelse mot infeksjon for både tidligere infiserte og immuniserte individer. Dette dokumentet beskriver en protokoll med høy gjennomstrømning ved hjelp av vesikulær stomatittvirus (VSV) pseudotypet med SARS-CoV-2 spike protein for å måle tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer i rekonvalesent serum fra pasienter som nylig har kommet seg fra COVID-19. Bruken av et replikerende pseudotypet virus eliminerer nødvendigheten av et anlegg på nivå 3 som kreves for SARS-CoV-2-håndtering, noe som gjør denne protokollen tilgjengelig for praktisk talt alle inneslutningsnivå 2-laboratorier. Bruken av et 96-brønns format gjør det mulig å kjøre mange prøver samtidig med en kort behandlingstid på 24 timer.
Introduction
I desember 2019 ble det identifisert et nytt koronavirus, som vi nå kjenner som SARS-CoV-2, årsaksmiddelet til koronavirussykdommen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er et betacoronavirus som tilhører Coronaviridae-familien. Disse innkapslede virusene utgjør et stort positivt RNA-genom og er ansvarlige for luftveis- og tarminfeksjoner hos både mennesker og dyr2. Per mai 2021 har det vært mer enn 157 millioner rapporterte tilfeller av COVID-19 globalt og mer enn 3,2 millioner dødsfall3. Utviklingen av en effektiv vaksine har blitt det primære målet for forskere over hele verden med minst 77 prekliniske vaksiner under undersøkelse og 90 som for tiden gjennomgår kliniske studier4.
Koronavirus koder fire strukturelle proteiner, inkludert piggproteinet (S), nukleocapsid (N), konvoluttprotein (E) og membranproteinet (M). Oppføring av SARS-CoV-2 krever interaksjon av reseptorbindingsdomenet (RBD) til S med vertsreseptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og påfølgende membranfusjon etter proteolytisk spalting av vertscelle serinprotease, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9, 10,10 . Humoral immunodominans av S-proteinet til SARS-CoV har tidligere blitt rapportert og har nå også blitt vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk har nøytraliserende antistoffresponser mot S blitt påvist i rekonvalesent serum fra SARS-CoV-pasienter 24 måneder etter infeksjon14, og fremhever deres kritiske rolle i den langsiktige immunresponsen. S-proteinet har blitt identifisert som et lovende vaksinemål og har dermed blitt en nøkkelkomponent i de fleste vaksiner under utvikling15,16.
Mens den raske påvisning av nøytraliserende antistoffer er et kritisk aspekt av vaksineutvikling, kan det også belyse infeksjonshastigheten og seroepidemiologisk overvåking i berørte områder17. En replikasjons-kompetent VSV pseudotypet med SARS-CoV-2 S glykoprotein, i stedet for wild-type VSV glykoprotein, for å studere SARS-CoV-2 infeksjon i biosikkerhet nivå 2 innstillinger ble vennlig donert av Whelan og medarbeidere18. VSV uttrykker spike (VSV-S) vil bli brukt til å bestemme nøytraliserende antistoff respons mot SARS-CoV-2 spike protein. Ettersom VSV-S som brukes her også uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP-foci påvises innen 24 timer for å kvantifisere infeksjon, mens plakkdannelse kan ta 48 til 72 timer. Oppsummert her er en enkel og effektiv protokoll for å bestemme evnen til rekonvalesens pasientserum for å nøytralisere VSV-S-eGFP-infeksjon. Denne metoden kan også enkelt tilpasses for å forhøre andre potensielle terapeutiske behandlinger som tar sikte på å forstyrre den verts-virale interaksjonen mellom SARS-CoV-2 S-protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrives her, kan tilpasses ulike laboratoriemiljøer og ressurser etter behov. Viktigst, hovedbegrensningen av denne protokollen er nødvendigheten av en inneslutning nivå 2 plass og vev kultur hette. Anvendelsen av et replikering av RNA-virus pseudotypet med SARS-CoV-2-spissen, for eksempel VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-viruset, som krever et inneslutningsnivå 3 arbeidsområde, men kan forbli en begrensning for noen grupper. Alle andre trinn som er beskrevet her, er ganske fleks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Whelan lab for sjenerøst å gi VSV-S-eGFP-viruset som brukes i denne protokollen (beskrevet i Case et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for å samle inn pasientblodprøvene (REB-protokoll-ID 20200371-01H). Forfatterne avslører mottak av følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskap og / eller publisering av denne artikkelen: Dette arbeidet ble finansiert av den sjenerøse støtten fra Ottawa Hospital Foundation og et stipend fra Canadian Institutes of Health Research (#448323) og et Fast Grant fra Thistledown-stiftelsen for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansiert av et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs fellowship. JP er finansiert av en klynge Mitacs fellowship. T.A. er finansiert av et CIHR Banting Fellowship. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
