Protokollen som er beskrevet her skisserer en rask og effektiv metode for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 spike protein ved å evaluere evnen til rekonvalesent serumprøver for å hemme infeksjon av et forbedret grønt fluorescerende proteinmerket vesikulær stomatittvirus pseudotyped med spike glykoprotein.
Ettersom COVID-19-pandemien forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsetter å utvikle seg, har det blitt tydelig at tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer mot viruset kan gi beskyttelse mot fremtidig infeksjon. Således, etter hvert som opprettelsen og oversettelsen av effektive COVID-19-vaksiner fortsetter med en enestående hastighet, vil utviklingen av raske og effektive metoder for å måle nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 bli stadig viktigere for å bestemme langsiktig beskyttelse mot infeksjon for både tidligere infiserte og immuniserte individer. Dette dokumentet beskriver en protokoll med høy gjennomstrømning ved hjelp av vesikulær stomatittvirus (VSV) pseudotypet med SARS-CoV-2 spike protein for å måle tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer i rekonvalesent serum fra pasienter som nylig har kommet seg fra COVID-19. Bruken av et replikerende pseudotypet virus eliminerer nødvendigheten av et anlegg på nivå 3 som kreves for SARS-CoV-2-håndtering, noe som gjør denne protokollen tilgjengelig for praktisk talt alle inneslutningsnivå 2-laboratorier. Bruken av et 96-brønns format gjør det mulig å kjøre mange prøver samtidig med en kort behandlingstid på 24 timer.
I desember 2019 ble det identifisert et nytt koronavirus, som vi nå kjenner som SARS-CoV-2, årsaksmiddelet til koronavirussykdommen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er et betacoronavirus som tilhører Coronaviridae-familien. Disse innkapslede virusene utgjør et stort positivt RNA-genom og er ansvarlige for luftveis- og tarminfeksjoner hos både mennesker og dyr2. Per mai 2021 har det vært mer enn 157 millioner rapporterte tilfeller av COVID-19 globalt og mer enn 3,2 millioner dødsfall3. Utviklingen av en effektiv vaksine har blitt det primære målet for forskere over hele verden med minst 77 prekliniske vaksiner under undersøkelse og 90 som for tiden gjennomgår kliniske studier4.
Koronavirus koder fire strukturelle proteiner, inkludert piggproteinet (S), nukleocapsid (N), konvoluttprotein (E) og membranproteinet (M). Oppføring av SARS-CoV-2 krever interaksjon av reseptorbindingsdomenet (RBD) til S med vertsreseptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og påfølgende membranfusjon etter proteolytisk spalting av vertscelle serinprotease, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9, 10,10 . Humoral immunodominans av S-proteinet til SARS-CoV har tidligere blitt rapportert og har nå også blitt vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk har nøytraliserende antistoffresponser mot S blitt påvist i rekonvalesent serum fra SARS-CoV-pasienter 24 måneder etter infeksjon14, og fremhever deres kritiske rolle i den langsiktige immunresponsen. S-proteinet har blitt identifisert som et lovende vaksinemål og har dermed blitt en nøkkelkomponent i de fleste vaksiner under utvikling15,16.
Mens den raske påvisning av nøytraliserende antistoffer er et kritisk aspekt av vaksineutvikling, kan det også belyse infeksjonshastigheten og seroepidemiologisk overvåking i berørte områder17. En replikasjons-kompetent VSV pseudotypet med SARS-CoV-2 S glykoprotein, i stedet for wild-type VSV glykoprotein, for å studere SARS-CoV-2 infeksjon i biosikkerhet nivå 2 innstillinger ble vennlig donert av Whelan og medarbeidere18. VSV uttrykker spike (VSV-S) vil bli brukt til å bestemme nøytraliserende antistoff respons mot SARS-CoV-2 spike protein. Ettersom VSV-S som brukes her også uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP-foci påvises innen 24 timer for å kvantifisere infeksjon, mens plakkdannelse kan ta 48 til 72 timer. Oppsummert her er en enkel og effektiv protokoll for å bestemme evnen til rekonvalesens pasientserum for å nøytralisere VSV-S-eGFP-infeksjon. Denne metoden kan også enkelt tilpasses for å forhøre andre potensielle terapeutiske behandlinger som tar sikte på å forstyrre den verts-virale interaksjonen mellom SARS-CoV-2 S-protein.
Metoden som beskrives her, kan tilpasses ulike laboratoriemiljøer og ressurser etter behov. Viktigst, hovedbegrensningen av denne protokollen er nødvendigheten av en inneslutning nivå 2 plass og vev kultur hette. Anvendelsen av et replikering av RNA-virus pseudotypet med SARS-CoV-2-spissen, for eksempel VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-viruset, som krever et inneslutningsnivå 3 arbeidsområde, men kan forbli en begrensning for noen grupper. Alle andre trinn som er beskrevet her, er ganske fleks…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Whelan lab for sjenerøst å gi VSV-S-eGFP-viruset som brukes i denne protokollen (beskrevet i Case et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for å samle inn pasientblodprøvene (REB-protokoll-ID 20200371-01H). Forfatterne avslører mottak av følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskap og / eller publisering av denne artikkelen: Dette arbeidet ble finansiert av den sjenerøse støtten fra Ottawa Hospital Foundation og et stipend fra Canadian Institutes of Health Research (#448323) og et Fast Grant fra Thistledown-stiftelsen for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansiert av et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs fellowship. JP er finansiert av en klynge Mitacs fellowship. T.A. er finansiert av et CIHR Banting Fellowship. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien.
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |