In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.
Abstract
La diferenciación y maduración de los megacariocitos se producen en estrecha asociación con los componentes celulares y extracelulares de la médula ósea. Estos procesos se caracterizan por la aparición gradual de estructuras esenciales en el citoplasma de megacariocitos, como un núcleo poliploide y polilobulado, una red de membrana interna llamada sistema de membrana de demarcación (DMS) y los gránulos densos y alfa que se encontrarán en las plaquetas circulantes. En este artículo, describimos un protocolo estandarizado para el estudio ultraestructural in situ de megacariocitos murinos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite la identificación de características clave que definen su etapa de maduración y densidad celular en la médula ósea. Las médulas óseas se enjuagan, se fijan, se deshidratan en etanol, se incrustan en resina plástica y se montan para generar secciones transversales. Las secciones semidelgado y delgado se preparan para observaciones histológicas y TEM, respectivamente. Este método se puede utilizar para cualquier célula de la médula ósea, en cualquier instalación de EM y tiene la ventaja de utilizar tamaños de muestra pequeños que permiten la combinación de varios enfoques de imagen en el mismo ratón.
Introduction
Los megacariocitos son células poliploides grandes especializadas, localizadas en la médula ósea, responsables de la producciónplaquetaria 1. Se originan a partir de células madre hematopoyéticas a través de un intrincado proceso de maduración, durante el cual los precursores de megacariocitos aumentan progresivamente de tamaño, mientras sufren extensos cambios morfológicos concomitantes en el citoplasma y el núcleo2. Durante la maduración, los megacariocitos desarrollan una serie de elementos estructurales distinguibles que incluyen: un núcleo polilobulado, invaginaciones de la membrana superficial que forman el sistema de membrana de demarcación (DMS), una zona periférica desprovista de orgánulos rodeada por la red citoesquelética basada en actina y numerosos orgánulos que incluyen gránulos α, gránulos densos, lisosomas y múltiples complejos de Golgi. A nivel ultraestructural, una modificación importante observada es la compartimentación citoplasmática en regiones discretas delimitadas por el DMS3. Este extenso suministro de membranas alimentará la extensión de largos procesos citoplasmáticos en la fase inicial de la producción de plaquetas, que luego se remodelarán en plaquetas dentro de la circulación. Cualquier defecto durante la diferenciación y maduración de megacariocitos puede afectar la producción de plaquetas en términos de recuento de plaquetas y / o función plaquetaria.
La microscopía electrónica de transmisión de capa delgada (TEM) ha sido el enfoque de imagen de elección durante décadas proporcionando una ultraestructura de alta calidad de megacariocitos que han dado forma a nuestra comprensión de la fisiología de la trombopoyesis4,5. Este artículo se centra en un método TEM estandarizado que permite capturar el proceso de biogénesis plaquetaria que ocurre in situ dentro del microambiente de la médula ósea nativa, que también podría servir como base para analizar cualquier tipo de célula de la médula ósea. Proporcionamos ejemplos ultraestructurales del desarrollo de megacariocitos desde inmaduros hasta completamente maduros, que extienden los procesos citoplasmáticos en la microcirculación de sinusoides6. También describimos un procedimiento fácil para cuantificar las diferentes etapas de maduración de los megacariocitos, instruyendo sobre la regeneración y la capacidad de producción de plaquetas de la médula ósea.
Protocol
Representative Results
Discussion
El examen directo de los megacariocitos en su entorno nativo es esencial para comprender la megacaripoyesis y la formación de plaquetas. En este manuscrito, proporcionamos un método de microscopía electrónica de transmisión que combina el lavado de la médula ósea y la fijación por inmersión, lo que permite diseccionar in situ las características morfológicas de todo el proceso de morfogénesis de megacariocitos que tiene lugar en la médula ósea.
El lavado de la médula ó…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y por la Subvención ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
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