In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi
Summary
Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV’da TEM mikroskobu altında gözlenir.
Abstract
Megakaryositlerin farklılaşması ve olgunlaşması, kemik iliğinin hücresel ve hücre dışı bileşenleri ile yakın ilişki içinde ortaya çıkar. Bu işlemler, poliploid ve polilobulat çekirdek gibi megakaryosit sitoplazmasındaki temel yapıların, sınır membran sistemi (DMS) adı verilen bir iç membran ağının ve dolaşımdaki trombositlerde bulunacak yoğun ve alfa granüllerinin kademeli olarak ortaya çıkması ile karakterize edilir. Bu yazıda, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak murine megakaryositlerin yerinde ultrayapısal çalışması için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmış haline getirilmiş ve kemik iliğindeki olgunlaşma evrelerini ve hücresel yoğunluklarını tanımlayan temel özelliklerin tanımlanmasını sağlamaktır. Kemik ilikleri yıkanır, sabitlenir, etanolde susuzlur, plastik reçineye gömülür ve kesitler oluşturmak için monte edilir. Histolojik ve TEM gözlemleri için sırasıyla yarı ince ve ince bölümler hazırlanır. Bu yöntem herhangi bir kemik iliği hücresi için, herhangi bir EM tesisinde kullanılabilir ve aynı fare üzerinde birkaç görüntüleme yaklaşımının kombinasyonuna izin sağlayan küçük örnek boyutları kullanma avantajına sahiptir.
Introduction
Megakaryositler, kemik iliğinde lokalize, trombosit üretiminden sorumlu özel büyük poliploid hücrelerdir1. Sitoplazma ve çekirdek2’dekapsamlı eşlik eden morfolojik değişikliklere uğrarken, megakaryosit öncüllerinin giderek arttığı karmaşık bir olgunlaşma süreci yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Olgunlaşma sırasında, megakaryositler aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi ayırt edilebilir yapısal eleman geliştirir: polilobürlenmiş bir çekirdek, sınır membran sistemini (DMS) oluşturan yüzey zarının invaginasyonları, aktin bazlı sitoskeletal ağ ile çevrili organellerden yoksun bir periferik bölge ve α granüller, yoğun granüller, lizozomlar ve çoklu Golgi kompleksleri dahil olmak üzere çok sayıda organel. Ultrayapı düzeyinde, gözlenen önemli bir değişiklik, DMS3tarafından sınırlandırılan ayrık bölgelere sitoplazmik bölmelemedir. Bu geniş membran kaynağı, trombosit üretiminin ilk aşamasında uzun sitoplazmik süreçlerin uzatılmasını körükleyecek ve daha sonra sirkülasyonun içindeki trombositlere dönüşecektir. Megakaryosit farklılaşması ve olgunlaşması sırasındaki herhangi bir kusur trombosit sayısı ve/veya trombosit fonksiyonu açısından trombosit üretimini etkileyebilir.
İnce tabaka iletim elektron mikroskopisi (TEM), trombopoezis4,5fizyolojisi anlayışımızı şekillendiren megakaryositlerin yüksek kaliteli ultrayapısını sağlayan onlarca yıldır tercih edilen görüntüleme yaklaşımıdır. Bu makale, herhangi bir kemik iliği hücre tipini analiz etmek için de temel teşkil edebilecek, yerli kemik iliği mikroçevriminde in situ meydana gelen trombosit biyogenez sürecini yakalamaya izin veren standartlaştırılmış bir TEM yöntemine odaklanmaktadır. Sitoplazmik süreçleri sinüzoidlerin mikrosirkülasyonuna genişleten olgunlaşmamışlıktan tamamen olgunluğa kadar megakaryositlerin gelişiminin ultrayapısal örneklerini sunuyoruz6. Ayrıca, kemik iliğinin rejenerasyon ve trombosit üretim kapasitesi konusunda talimat veren farklı megakaryosit olgunlaşma aşamalarını ölçmek için kolay bir prosedür açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Megakaryositlerin kendi ortamlarında doğrudan incelenmesi, megakaryopoez ve trombosit oluşumunu anlamak için gereklidir. Bu yazıda, kemik iliğinde gerçekleşen megakaryosit morfogenezinin tüm sürecinin morfoloji özelliklerini yerinde inceleyerek kemik iliği yıkama ve fiksasyonunu daldırma ile birleştiren bir iletim elektron mikroskopi yöntemi sunuyoruz.
Kemik iliğinin yıkanması bu yöntemin kritik bir adımıdır, çünkü yüksek kaliteli bir yıkamanın başarısı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım için Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund’a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından H.d.S.’ye desteklendi.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
