In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.
Abstract
Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten erfolgen in enger Verbindung mit den zellulären und extrazellulären Komponenten des Knochenmarks. Diese Prozesse sind durch das allmähliche Auftreten essentieller Strukturen im Megakaryozytenzytoplasma wie einem polyploiden und polylobulierten Kern, einem internen Membrannetzwerk namens Demarkationsmembransystem (DMS) und den dichten und Alpha-Granula, die in zirkulierenden Blutplättchen gefunden werden, gekennzeichnet. In diesem Artikel beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die in situ ultrastrukturelle Untersuchung von murinen Megakaryozyten mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), das die Identifizierung von Schlüsselmerkmalen ermöglicht, die ihr Reifestadium und ihre Zelldichte im Knochenmark definieren. Knochenmark wird gespült, fixiert, in Ethanol dehydriert, in Kunststoffharz eingebettet und zur Erzeugung von Querschnitten montiert. Halbdünne und dünne Schnitte werden für histologische bzw. TEM-Beobachtungen hergestellt. Diese Methode kann für jede Knochenmarkzelle in jeder EM-Einrichtung verwendet werden und hat den Vorteil, dass kleine Stichprobengrößen verwendet werden, die die Kombination mehrerer Bildgebungsansätze auf derselben Maus ermöglichen.
Introduction
Megakaryozyten sind spezialisierte große polyploide Zellen, die im Knochenmark lokalisiert sind und für die Thrombozytenproduktion verantwortlich sind1. Sie stammen aus hämatopoetischen Stammzellen durch einen komplizierten Reifungsprozess, bei dem Megakaryozytenvorläufer zunehmend an Größe zunehmen, während sie gleichzeitig umfangreiche morphologische Veränderungen im Zytoplasma und im Zellkern erfahren2. Während der Reifung entwickeln Megakaryozyten eine Reihe von unterscheidbaren Strukturelementen, darunter: ein polylobulierter Kern, Einfärbungen der Oberflächenmembran, die das Demarkationsmembransystem (DMS) bilden, eine periphere Zone ohne Organellen, die vom Aktin-basierten Zytoskelettnetzwerk umgeben ist, und zahlreiche Organellen, darunter α-Granula, dichte Granula, Lysosomen und mehrere Golgi-Komplexe. Auf der ultrastrukturellen Ebene ist eine wesentliche Beobachtete Modifikation die zytoplasmatische Kompartimentierung in diskrete Regionen, die durch das DMS3begrenzt werden. Diese umfangreiche Versorgung mit Membranen wird die Verlängerung langer zytoplasmatischer Prozesse in der Anfangsphase der Thrombozytenproduktion vorantreiben, die sich dann im Kreislauf in Blutplättchen umwandeln. Jeder Defekt während der Megakaryozytendifferenzierung und -reifung kann die Thrombozytenproduktion in Bezug auf die Thrombozytenzahl und / oder die Thrombozytenfunktion beeinflussen.
Die Dünnschichttransmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist seit Jahrzehnten der bildgebende Ansatz der Wahl und bietet eine qualitativ hochwertige Ultrastruktur von Megakaryozyten, die unser Verständnis der Physiologie der Thrombopoese geprägt haben4,5. Diese Arbeit konzentriert sich auf eine standardisierte TEM-Methode, die es ermöglicht, den Prozess der Thrombozytenbiogenese in situ innerhalb der nativen Knochenmark-Mikroumgebung zu erfassen, die auch als Grundlage für die Analyse eines beliebigen Knochenmarkzelltyps dienen könnte. Wir liefern ultrastrukturelle Beispiele für die Entwicklung von Megakaryozyten von unreif bis voll ausgereift, die zytoplasmatische Prozesse in die Mikrozirkulation von Sinusoiden ausdehnen6. Wir beschreiben auch ein einfaches Verfahren zur Quantifizierung der verschiedenen Megakaryozyten-Reifungsstadien, das die Regenerations- und Thrombozytenproduktionskapazität des Knochenmarks anleitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung ist unerlässlich, um Megakaryopoese und Thrombozytenbildung zu verstehen. In diesem Manuskript stellen wir eine Transmissionselektronenmikroskopie-Methode zur Verfügung, die Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen kombiniert und es ermöglicht, die morphologischen Eigenschaften des gesamten Prozesses der Megakaryozytenmorphogenese im Knochenmark in situ zu sezieren.
Die Spülung des Knochenmarks is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), der Europäischen Union über den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und durch den Zuschuss ANR-17-CE14-0001-01 an H.d.S. unterstützt.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
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