Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu
Summary
Bu yöntem, MEP ve MKp’nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.
Abstract
Kemik iliği megakaryositleri kan trombositlerinin üretimini sağlayan büyük poliploid hücrelerdir. Megakaryopoez yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Bu sürecin son aşamaları karmaşıktır ve klasik olarak bipotent Megakaryosit-Eritrosit Progenitors (MEP) ve tek kişilik Megakaryosit Progenitors ‘u (MKp) içerir. Bu popülasyonlar iyi niyetli megakaryositlerin oluşumundan önce gelir ve bu nedenle izolasyonları ve nitelemeleri megakaryosit oluşumunun sağlam ve tarafsız analizine izin verebilir. Bu protokol, fare kemik iliğinden hematopoetik hücreleri toplama prosedürünü, hematopoetik progenitörlerin manyetik tükenme yoluyla zenginleştirilmesini ve son olarak yüksek oranda saflaştırılmış MEP ve MKp popülasyonları veren bir hücre sıralama stratejisini ayrıntılı olarak sunar. İlk olarak, kemik iliği hücreleri femurdan, kaval kemiğinden ve ayrıca yüksek sayıda hematopoetik progenitör içeren bir kemik olan iliak arktan toplanır. İlyak tepe kemiklerinin kullanımı, fare başına elde edilen toplam hücre sayısını büyük ölçüde arttırır ve böylece hayvanların daha etik bir şekilde kullanılmasına katkıda bulunur. Manyetik soy tükenmesi, akış sitometrisine göre çok verimli bir hücre sıralamaya izin vererek 450 nm manyetik boncuk kullanılarak optimize edildi. Son olarak, protokol iki yüksek saflaştırılmış megakaryosit progenitör popülasyonunun sıralanması için etiketleme ve gating stratejisini sunar: MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9dim)ve MKp (Lin– Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9parlak ). Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve i) kimlikleri ve biyolojileri hakkında daha derin bir bilgi için moleküler karakterizasyon, ii) megakaryositlerin olgunlaşma mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacak in vitro farklılaşma tahlilleri veya iii) mikroçevrimle etkileşimin in vitro modellerini gerçekleştirmek için yeterli hücresel materyal sağlar.
Introduction
Kan trombositleri megakaryositler tarafından üretilir. Bu büyük poliploid hücreler kemik iliğinde bulunur ve tüm kan hücrelerine gelince Hematopoetik Kök Hücrelerden (HSC) türetilirler1. Kemik iliğindeki megakaryositlerin klasik üretim yolu HSC’den kaynaklanır ve farklılaşma potansiyellerini giderek kısıtlayan farklı ataların neslini içerir2. Megakaryosit soyuna bağlılığı imzalayan ilk ata, hem eritroid hücreleri hem de megakaryositler3,4,5 üretebilen bir bipotent progenitör olan Megakaryosit-Eritrosit Progenitor‘dur(MEP). MEP daha sonra trombosit üretebilen olgun bir megakaryosit olarak farklılaşacak tek kişilik bir ata /öncül (MKp) üretir. Bu ataların üretilmesinde yer alan mekanizmaların yanı sıra megakaryositlere farklılaşmaları ve olgunlaşmaları karmaşıktır ve sadece kısmen anlaşılmıştır. Ayrıca MEP popülasyonunun farklılaşma potansiyeli açısından heterojenliği ve bu hücrelerin içsel bağlılık düzeyi hala belirsizdir. Bu süreçleri deşifre etmek için, ince moleküler ve tek hücreli analizler için MEP ve MKp’nin saflaştırılmış popülasyonlarını elde etmek (veya bunlara erişmek) esastır.
Çeşitli çalışmalar, fare 6,7,8’dekimegakaryositik soyuna bağlı atalarıntanımlanması için hücre yüzeyi belirteçlerinin belirli kombinasyonlarını göstermiştir. Bunlardan MEP ve MKp’nin farelerden arındırılmasına izin sağlayan bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem, çok sayıda tahlil için yeterli sayıda ve kalitede hücre elde etmek için optimize edilmiştir. Etik hususları göz önünde bulundurarak ve deneylerde yer alan hayvan sayısını en aza indirmek için kemik iliğini femur ve kaval kemiğinden ve ayrıca iliak arktan hasat etmek için ortaya çıkarız. Bu kemik yüksek sıklıkta ve hematopoetik ataların sayısını içerir ve çoğu zaman uzun kemik hasadı sırasında hasar görür. Burada sunulan bu kemiğin güvenilir toplanması için ayrıntılı bir yöntemdir.
Optimizasyonun ikinci kriteri, yüksek oranda saflaştırılmış hücre popülasyonları üretmektir. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS), arıtılmış hücre popülasyonları elde etmek için tercih edilen bir yöntemdir. Bununla birlikte, ilgi hücre popülasyonu çok nadir olduğunda düşük verime ulaşılır. Bu nedenle zenginleştirme prosedürleri gereklidir. Bu protokolde manyetik boncuklar kullanılarak negatif bir seçim prosedürü tercih edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntem, fare MEP ve MKp’nin çıkarılmasına ve saflaştırılmasına izin verir. Protokolün optimizasyonunda önemli bir parametre, çoğu moleküler ve hücresel tabanlı tahlille uyumlu yeterli sayıda hücre elde etmekti. Hematopoetik hücre ekstraksiyonu için fare kemiği toplamanın genel uygulaması genellikle her farenin hem uyluk kemiğinin hem de kaval kemiğinin toplanmasından oluşur. Hematopoetik malzemenin başka bir kaynağı olan pelvik kemik, bu nedenle sıklıkla göz ardı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar monique Freund, Catherine Ziessel ve Ketty’ye teknik yardım için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından Henri.de la’ya desteklendi. Salle.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
References
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
- Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
- Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
- Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
- Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
- Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).
