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Biology

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Published: May 20, 2021 doi: 10.3791/62498
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, 2UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

ERRATUM NOTICE

Summary

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Abstract

Knochenmark-Megakaryozyten sind große polyploide Zellen, die die Produktion von Blutplättchen sicherstellen. Sie entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen durch Megakaryopoese. Die Endstadien dieses Prozesses sind komplex und umfassen klassischerweise die bipotenten Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer (MEP) und die unipotenten Megakaryozyten-Vorläufer (MKp). Diese Populationen gehen der Bildung von echten Megakaryozyten voraus, und als solche könnte ihre Isolierung und Charakterisierung eine robuste und unvoreingenommene Analyse der Megakaryozytenbildung ermöglichen. Dieses Protokoll stellt detailliert das Verfahren zur Sammlung hämatopoetischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus, die Anreicherung hämatopoetischer Vorläufer durch magnetische Depletion und schließlich eine Zellsortierungsstrategie vor, die hochreine MEP- und MKp-Populationen ergibt. Zuerst werden Knochenmarkzellen aus dem Femur, der Tibia und auch dem Beckenkamm, einem Knochen, der eine hohe Anzahl hämatopoetischer Vorläufer enthält, gesammelt. Die Verwendung von Beckenkammknochen erhöht drastisch die Gesamtzellzahl pro Maus und trägt somit zu einer ethischeren Verwendung von Tieren bei. Eine magnetische Linienverarmung wurde unter Verwendung von 450 nm magnetischen Kügelchen optimiert, was eine sehr effiziente Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Schließlich präsentiert das Protokoll die Markierungs- und Gating-Strategie für die Sortierung der beiden hochreinen Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) und MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9hell ). Diese Technik ist einfach zu implementieren und liefert genügend zelluläres Material, um i) molekulare Charakterisierung für ein tieferes Wissen über ihre Identität und Biologie, ii) In-vitro-Differenzierungsassays, die ein besseres Verständnis der Mechanismen der Reifung von Megakaryozyten liefern, oder iii) In-vitro-Modelle der Interaktion mit ihrer Mikroumgebung durchzuführen.

Introduction

Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert. Diese großen polyploiden Zellen befinden sich im Knochenmark und stammen wie alle Blutzellen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSC)1. Der klassische Weg der Produktion von Megakaryozyten im Knochenmark stammt von HSC und beinhaltet die Erzeugung verschiedener Vorläufer, die ihr Differenzierungspotenzial progressiv einschränken2. Der erste Vorläufer, der das Engagement für die megakaryozytäre Linie unterzeichnet, ist der Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), ein bipotenter Vorläufer, der sowohl erythroide Zellen als auch Megakaryozyten produzieren kann3,4,5. Der MEP produziert dann einen unipotenten Vorläufer / Vorläufer (MKp), der sich zu einem reifen Megakaryozyten differenziert, der in der Lage ist, Blutplättchen zu produzieren. Die Mechanismen, die an der Erzeugung dieser Vorläufer beteiligt sind, sowie ihre Differenzierung und Reifung zu Megakaryozyten sind komplex und nur teilweise verstanden. Darüber hinaus sind die Heterogenität der MEP-Population in Bezug auf das Differenzierungspotenzial und das intrinsische Engagement dieser Zellen noch unklar. Um diese Prozesse zu entschlüsseln, ist es wichtig, gereinigte Populationen von MEP und MKp für feine molekulare und Einzelzellanalysen zu erhalten (oder Zugang zu ihnen zu haben).

Mehrere Studien haben bestimmte Kombinationen von Zelloberflächenmarkern für die Identifizierung von Vorläufern gezeigt, die der megakaryozytären Linie in der Maus zugesetzt sind6,7,8. Aus diesen wurde eine Methode entwickelt, die die Reinigung von MEP und MKp von Mäusen ermöglicht. Diese Methode wurde optimiert, um Zellen in ausreichender Anzahl und Qualität für eine große Anzahl von Assays zu erhalten. Aus ethischen Gründen und um die Anzahl der an den Experimenten beteiligten Tiere zu minimieren, haben wir die Entnahme des Knochenmarks aus dem Femur und der Tibia sowie aus dem Beckenkamm veranlasst. Dieser Knochen enthält eine hohe Häufigkeit und Anzahl von hämatopoetischen Vorläufern und wird die meiste Zeit während der langen Knochenentnahme beschädigt. Hier wird eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Sammlung dieses Knochens vorgestellt.

Das zweite Optimierungskriterium ist die Herstellung hochreiner Zellpopulationen. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) ist eine Methode der Wahl, um gereinigte Populationen von Zellen von Interesse zu erhalten. Niedrige Erträge werden jedoch erreicht, wenn die Zellpopulation von Interesse sehr selten ist. Anreicherungsverfahren sind daher notwendig. In diesem Protokoll wurde ein negatives Selektionsverfahren unter Verwendung von Magnetperlen gewählt.

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Protocol

Die Protokolle mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Genehmigungsnummer: E67-482-10).

1. Sammlung von Mausknochen

  1. Opfern Sie das Tier in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien.
    HINWEIS: Die in diesem Manuskript präsentierten Daten stammen von C57Bl/6-Mäusen im Alter von 8 bis 12 Wochen. Die Anzahl der erhaltenen Zellen und die Häufigkeit der zitierten Populationen können je nach Alter und Mausstamm variieren.
  2. Besprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol.
  3. Machen Sie mit einer Schere einen 0,5-1 cm langen Schnitt der Haut senkrecht zur Wirbelsäule und reißen Sie die Haut um den ganzen Körper herum. Ziehen Sie die Haut vom Unterkörper herunter und entfernen Sie die Haut.
  4. Legen Sie das Tier mit dem Gesicht nach unten auf das Sezierpad. Lokalisieren Sie die Beckenknochen, indem Sie Ihre Finger entlang der freiliegenden Wirbelsäule von oben nach unten gleiten lassen. Um den Beckenkamm zu lokalisieren, identifizieren Sie die kleine Beule in der Lendengegend in der Nähe der Hinterbeine (die anterosuperiorische Region des Beckenknochens). Abbildung 1A,B zeigt eine schematische Darstellung der Anatomie der Maus.

Figure 1
Abbildung 1: Anatomie der Maus. (A) Röntgenaufnahme der Maus, die die Hinterbeinknochen zeigt. Beachten Sie den Raum zwischen dem Beckenknochen und der Wirbelsäule (gelber Pfeil), wo die Schere eingeführt werden muss, um die Hinterbeine richtig vom Körper der Maus zu trennen (gelbe gepunktete Linie). (B) Schematische Darstellung der knochenmarkreichen Knochen von Interesse. Die Beckenknochen sind rot, die Oberschenkelknochen lila und die Tibias grün dargestellt. (C) Schematische Darstellung des Beckenknochens der Maus. Das Darmbein entspricht dem markreichen Teil des Beckenknochens und ist rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Legen Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule gegen die Wirbel und in die Nähe der Beckenkammbeule. Fahren Sie fort, die Muskeln entlang der Seite der Wirbelsäule über dem Beckenknochen zu schneiden, indem Sie die Schere entlang der Wirbel bis zum Schwanz gleiten lassen.
    HINWEIS: Dieser erste Muskelabschnitt kann auch mit einer Skalpellklinge durchgeführt werden.
  2. Legen Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule und schneiden Sie zwischen den Wirbeln und dem Beckenkamm, wie durch die gelb gepunktete Linie in Abbildung 1Aangezeigt . Achten Sie darauf, so nah wie möglich an den Wirbeln zu bleiben. Schneiden Sie die verbleibenden Muskeln ab, um die Extremität vom Körper zu lösen.
    HINWEIS: Es sollte wenig bis gar keinen Widerstand geben.
  3. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite, um das zweite Glied zu lösen.
  4. Übertragen Sie die Gliedmaßen auf eine saubere Oberfläche und entsorgen Sie den Rest des Körpers in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien.
  5. Legen Sie die Becken-, Oberschenkel- und Tibiaknochen frei, indem Sie so viel umgebendes Gewebe wie möglich mit der Pinzette und den Skalpellen entfernen.
  6. Fahren Sie fort, den Hüftkopf vorsichtig vom Beckenknochen zu entfernen, indem Sie das distale Ende des Femurs mit der Pinzette halten, während Sie die Muskeln um die Artikulation mit den Skalpellen sanft schneiden. Wackeln Sie die Knochen, um die Luxation zu erleichtern.
  7. Kratzen Sie den verbleibenden Muskel vom Beckenknochen ab und schneiden Sie mit einem Skalpell in der Mitte der Höhle, die den Femurkopf hielt. Das Darmbein wird gehalten, da es reich an hämatopoetischen Vorläufern ist, während die dreieckige, sehr dünne Seite des Knochens verworfen wird, wie in Abbildung 1Cgezeigt.
  8. Entfernen Sie die Restgewebe um das Darmbein mit dem Skalpell und legen Sie den gereinigten Knochen in steriles PBS, ergänzt mit 2% Newborn Calf Serum (PBS-2% NBCS).
  9. Schneiden Sie mit einer Schere den Fuß vom Bein am Knöchel ab.
  10. Halten Sie den unteren Teil der Tibia mit der Pinzette und kratzen Sie den Muskel in Richtung Knie. Entsorgen Sie die Fibeln und schneiden Sie mit dem Skalpell über das Tibiaplateau. Legen Sie die Tibia in steriles PBS-2% NBCS.
  11. Entfernen Sie die Restgewebe um den Femur mit Skalpellen.
  12. Halten Sie die Oberseite des Femurs mit einer Pinzette; Legen Sie die Skalpellklinge an die Basis der Kniescheibe. Wenden Sie eine Kraft in Richtung der Kniescheibe parallel zum Femur bis zur Ablösung der Kniescheibe an. Legen Sie den Femur in steriles PBS-2% NBCS. Das Entfernen der Kniescheibe bietet einen sauberen Zugang zum Einführen der Nadel für die Markspülung.

2. Magnetische Erschöpfung von linienpositiven Zellen

  1. Übertragen Sie die Knochen in einem Laminar-Flow-Schrank in eine sterile Petrischale, die mit sterilem PBS-2% NBCS gefüllt ist.
  2. Mit einem Skalpell den Kopf der Oberschenkelknochen abschneiden.
  3. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit sterilem PBS-2% NBCS und befestigen Sie eine 21 G Nadel am Auslass.
  4. Füllen Sie ein 5-ml-Polypropylenröhrchen mit 2 ml sterilem PBS-2% NBCS.
  5. Halten Sie den Femur mit der Pinzette; Führen Sie die Nadel vorsichtig in die nach der Entfernung der Kniescheibe linke Rille ein. Wenden Sie während des Einführens eine Rotation auf die Nadel an, um ein Verstopfen der Nadel zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Nadel bis zur Fase vollständig in den Knochen eingeführt ist.
  6. Übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das 2 ml PBS-2% NBCS enthält. Geben Sie das PBS-2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist.
  7. Entfernen Sie die Nadel vom Femur und führen Sie sie in das Loch auf der gegenüberliegenden Seite ein, wo sich der Femurkopf befand. Den Puffer wieder abgeben und absaugen und den Knochen entsorgen.
  8. Für den Beckenkamm und die Tibia halten Sie den Knochen mit der Pinzette; Führen Sie die Nadel vorsichtig in die offene Seite ein. Wenden Sie während des Einführens eine Rotation auf die Nadel an, um ein Verstopfen der Nadel zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Nadel bis zur Fase vollständig in den Knochen eingeführt ist. Übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das 2 ml PBS-2% NBCS enthält. Geben Sie das PBS-2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist. Entsorgen Sie die Knochen.
    HINWEIS: Knochen von bis zu drei Mäusen können in dieselbe Röhre gespült werden. Poolen Sie die Zellsuspensionen.
  9. Führen Sie die gepoolte Zellsuspension durch eine 40 μm Zellsiebkappe, die auf ein steriles 5 ml Polystyrolröhrchen aufgetragen wird.
  10. Fahren Sie mit dem Zählen der Zellen fort.
    HINWEIS: Die Zellzahl kann mit jedem Hämozytometer, mit Trypan Blue zur Beurteilung der Lebensfähigkeit oder mit jedem automatisierten Zellzähler durchgeführt werden. Eine Maus liefert typischerweise 105 ± 7 x 106 Zellen.
  11. Nehmen Sie 100 μL der Zellsuspension als Gesamtknochenmark beiseite, fügen Sie 500 μL PBS-2% NBCS hinzu und bewahren Sie es für das Färbeverfahren auf Eis auf.
  12. Die filtrierte Suspension wird durch Zentrifugieren bei 400 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entsorgt.
    HINWEIS: Rote Blutkörperchen können lysiert werden, indem das Pellet in frisch zubereiteter Lyselösung (1/10in dH2O) wiederverwendet wird. 5 min inkubieren, bis die Suspension klar und leuchtend rot wird, und 10 Volumen steriles PBS hinzufügen. Fahren Sie fort, die Zellen in PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 Minuten bei 4 °C zu waschen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Überstand entfernen, da das Zellpellet sehr locker ist. Führen Sie eine zweite Wäsche mit PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C durch und fahren Sie mit Schritt 2.13 fort.
  13. Resuspendieren Sie das Zellpellet in frisch zubereiteten primären Antikörpercocktail mit einem Verhältnis von 100 μL pro 1 x 107 Zellen. 30-45 Min. auf Eis inkubieren.
Antikörper Verdünnung
Gr-1-Biotin 1:500
B220-Biotin 1:500
Mac-1-Biotin 1:500
CD3-Biotin 1:500
CD4-Biotin 1:500
CD5-Biotin 1:500
CD8-Biotin 1:500
TER119-Biotin 1:1000
CD127-Biotin 1:500

Tabelle 1.

  1. 10 μL der Zellsuspension in ein steriles 5 mL Polystyrolröhrchen mit der Bezeichnung Lin-Pos Fraction geben. Fügen Sie 90 μL PBS-2% NBCS hinzu und bewahren Sie es für das Färbeverfahren auf Eis auf.
  2. Fahren Sie fort, die Zellen zweimal mit sterilem PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zu waschen. Stellen Sie sicher, dass Sie die letzte Wäsche in einem sterilen 5-ml-Polypropylenröhrchen durchführen.
  3. Bereiten Sie während der Waschschritte die Perlen auf die magnetische Erschöpfung vor.
    1. Resuspendieren Sie die Perlen in der Durchstechflasche, indem Sie 30 s lang gründlich wirbeln.
    2. Übertragen Sie ein Volumen von Perlen, das zwei Perlen pro Zielzelle entspricht, in ein 5 ml Polypropylenröhrchen.
    3. Waschen Sie die Perlen zweimal mit PBS-2% NBCS, indem Sie das Röhrchen auf den Magneten legen und den Waschpuffer mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas entfernen.
    4. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 500 μL sterilem PBS-2NBCS%.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet der markierten Zellen in 250 μL Perlen und mischen Sie vorsichtig für 5 min auf Eis. Fügen Sie 2 ml steriles PBS-2% NBCS hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Schütteln Sie das Röhrchen nicht.
  5. Legen Sie das Rohr für 2 min auf den Magneten.
  6. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas und geben Sie sie auf die verbleibenden 250 μL Magnetperlen. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm.
  7. Legen Sie das Rohr für 20 min bei 4 °C auf eine Rohrwalze.
  8. Fügen Sie 2 ml steriles PBS-2% NBCS hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Schütteln Sie das Röhrchen nicht.
  9. Legen Sie das Rohr für 2 min in den Magneten.
  10. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion in einem sterilen 5-ml-Polypropylenröhrchen mit der Bezeichnung Lin-Neg-Fraktion mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas.
  11. Die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C pelletieren und den Überstand entfernen.
  12. Resuspendieren Sie die nichtmagnetischen Zellen in 500 μL sterilem PBS-2% NBCS.
  13. Fahren Sie mit dem Zählen der Zellen fort.
    HINWEIS: Eine Maus liefert typischerweise 3,9 ± 1,1 x 106 Zellen. Typische Abstammungsfärbungen vor und nach der Depletion sind in Abbildung 2B dargestellt.

3. Zellsortierung von Megakaryozyten-Vorläufern mittels Durchflusszytometrie

  1. Nehmen Sie die Röhrchen mit der Bezeichnung Total Bone Marrow, Lin-Pos Fraction und Lin-Neg Fraction.
  2. Fahren Sie fort, den Inhalt des Röhrchens Total Bone Marrow gleichmäßig in sechs sterile 5 ml Polystyrolröhrchen aufzuteilen. Beschriften Sie die Tuben mit den Zahlen 1-6.
  3. Fahren Sie fort, die Tube Lin-Pos Fraction mit der Zahl 7 zu beschriften.
  4. Fahren Sie fort, den Inhalt der Tube Lin-Neg Fraction wie folgt aufzuteilen.
    1. 50 μL in ein steriles 5 mL Polystyrolröhrchen mit 250 μL sterilem PBS-2%NBCS überführen. Dann teilen Sie seinen Inhalt gleichmäßig in 3 sterile 5 ml Polystyrolröhrchen auf. Beschriften Sie diese Tuben mit den Nummern 8-10.
    2. Die restlichen 450 μL der Lin-Neg Fraction Zellsuspension entsprechen dem Röhrchen mit der Nummer 11.
  5. Die Antikörper werden wie in Tabelle 2beschrieben in die Röhrchen gegeben.
Rohr Etikett Antikörper-Cocktail
Knochenmark gesamt
1 Unbefleckte Kontrolle
2 Einzelne gefärbte Steuerung CD45-FITC (1/200)
3 Einzelne gefärbte Steuerung CD45-PE (1/200)
4 Einzelne gefärbte Steuerung TER119-APC (1/200)
5 Einzelne gefärbte Steuerung CD45-PECy7 (1/200)
6 Einzelne gefärbte Steuerung CD45-APC-Cy7 Biotin (1/200)
Lin-Pos Fraktion
7 Einzelne gefärbte Steuerung Einzelne gefärbte Kontrolle. Streptavidin-APC-Cy7 (1:500)
Lin-Neg-Fraktion
8 FMO FITC Steuerung c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
9 FMO PE-Steuerung CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
10 FMO PECy7 Steuerung CD9-FITC (1/200) + C-Kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)
11 Positives Röhrchen zum Sortieren CD9-FITC (1/200) + C-Kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)

Tabelle 2.

  1. Inkubieren Sie auf Eis für 30-45 min im Dunkeln.
  2. Waschen Sie die Zellen mit sterilem PBS-2% NBCS durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
  3. Resuspendieren Sie die Zellpellets wie folgt.
    1. Für die Röhrchen 1 bis 10 wird das Pellet in 300 μL sterilem PBS-2%NBCS, ergänzt mit 7AAD (2,5 μg/ml endg) (PBS-7AAD), resuspendiert.
      ACHTUNG: 7AAD ist ein DNA-Interkalans und muss daher mit entsprechender PSA (Handschuhe) gehandhabt werden.
    2. Für Röhrchen 11 wird das Pellet in sterilem PBS-7AAD in einer maximalen Konzentration von 5 x 10 6 Zellen pro ml undeinem Mindestvolumen von 1 ml resuspendiert.
  4. Bereiten Sie zwei Polypropylen-Sammelröhrchen mit der Bezeichnung MEP und MKp vor, die 2 ml PBS-2% NBCS enthalten.
    HINWEIS: Alternativ können Zellen in Abhängigkeit von der anschließenden Anwendung für die sortierten Zellen in Kulturmedium oder Zelllysepuffer gesammelt werden. Die Verwendung von Polystyrolröhrchen wird wegen möglicher Interferenzen mit den geladenen Tröpfchen, die die interessierenden Zellen enthalten, nicht empfohlen.
  5. Halten Sie alle Röhren im Dunkeln auf Eis.
  6. Fahren Sie mit der Einrichtung des Zellensortierers fort.
    1. Verwenden Sie die Röhren 1-7, um Spannung und Kompensation einzurichten, die Röhren 7-10, um die Sortiergatter für die Zellpopulationen von Interesse zu bestimmen, und Röhre 11 für die Zellsortierung.
  7. Die ersten Schritte der Gating-Strategie zielen darauf ab, Dubletten und tote Zellen von der Analyse auszuschließen, wie in Abbildung 3beschrieben. Identifizieren Sie einzelne lebensfähige Zellen und zeigen Sie das SSC-vs Lin-APC-Cy7-Punktdiagramm an, um die Effizienz der Abstammungsverarmung zu bestätigen. Aus denLin-Zellen wird ein Gate gesetzt, um Zellen auszuwählen, die positiv für C-Kit und negativ oder dim für Sca-1 und CD16/32 sind. Ein CD9 vs CD150 Expression Dot Plot für die ausgewählten Zellen ermöglicht die Identifizierung von vier Populationen.
    HINWEIS: MEP- und MKp-Zellen sind beide positiv für CD150. Für CD9 können drei Ausdrucksebenen definiert werden (neg, dim und high). MKp exprimiert einen hohen CD9-Gehalt und MEP-Express-CD9 bei einer mittleren Fluoreszenzintensität. MEP Population entspricht Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim und MKp Population entspricht Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9hell. Die Unterscheidung zwischen CD9 high und CD9 dim Populationen für die CD150 positiven Zellen wird basierend auf dem maximalen Niveau der CD9-Expression in der CD150 negativen Population festgelegt. Eine Maus liefert typischerweise 5,3 ± 0,6 x 103 MKp und 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.

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Representative Results

Die phänotypische Analyse der als MEP und MKp identifizierten Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Zellen wurden mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen CD41a und CD42c, klassische Marker der megakaryozytären und Thrombozytenlinien, markiert. Beide Marker wurden von den Zellen der MKp-Population exprimiert, während diese Marker an der Oberfläche der Zellen der MEP-Population noch nicht nachgewiesen sind (Abbildung 4Ai,4Aii). Polyploidie ist ein Kennzeichen von Megakaryozyten. Der DNA-Gehalt der sortierten Populationen wurde ebenfalls analysiert und gezeigt, dass die Zellen für die MEP-Population meist 2N und ein kleiner Teil der MKp-Zellen 4N sind, aber eine höhere Ploidie in diesen Populationen nicht signifikant nachgewiesen wird (Abbildung 4Aiii).

Um die Identität der sortierten Zellpopulationen zu bestätigen, wurden mehrere Differenzierungsassays durchgeführt, um ihre Fähigkeit zur Differenzierung in Richtung der megakaryozytären und erythroiden Linien zu bewerten. Zunächst wurden halbfeste klonogene Assays durchgeführt, um megakaryozytäre Vorläufer (CFU-MK) und erythroide Vorläufer (BFU-E) zu quantifizieren. CFU-MK wurden sowohl in MEP- als auch in MKP-Populationen nachgewiesen, jedoch nicht in der anderen getesteten Population (Abbildung 4B). BFU-E wurden nicht in der MKp-Population, aber in der MEP-Population und der CD150-CD9-Dim-Cell-Population nachgewiesen (Abbildung 4C).

Die Differenzierung der sortierten Zellen wurde auch in Flüssigkultur in Gegenwart einer geringen Konzentration hämatopoetischer Zytokine verfolgt. Repräsentative Aufnahmen aus mikroskopischer Beobachtung am3. Tag der Differenzierung zeigen, dass MEP und MKp hauptsächlich Megakaryozyten produzierten, die als große Zellen identifiziert werden (Abbildung 5Aiii,5Aiv). Megakaryozyten wurden mittels CD41- und CD42c-Expression identifiziert und repräsentieren 53,9 ± 10,4% bzw. 82,0 ± 2,0% der Zellen, die aus MEP- bzw. MKp-Zellpopulationen hergestellt wurden (Abbildung 5B). Bemerkenswert ist, dass die Ploidie der megakaryozyten, die mit dem DNA-Marker Hoescht 33242 analysiert wurden, für den megakaryozyten, der aus der MKp-Population stammt, im Vergleich zur MEP-Population größer war, was auf einen reiferen Zustand hindeutet (Abbildung 5C). Schließlich wurden die Zellen, die am3. Tag aus jeder Population produziert wurden, einem Proplatletbildungstestunterzogen 9. Es wurde beobachtet, dass nur die aus der MKp-Population abgeleiteten Zellen in diesem Zustand zur Proplatletemission fähig waren (Abbildung 5D). Dies deutet auf ein fortgeschritteneres Reifestadium für die MKp-Population hin. Wenn die Kulturdauer auf 4-5 Tage verlängert wird, verlängern Megakaryozyten, die aus MEP erzeugt werden, auch Proplatele.

Figure 2
Abbildung 2: Magnetische Erschöpfung von Stammzellen (Lin) ( A) Schematische Darstellung des magnetischen Erschöpfungsprotokolls. Zunächst werden unsortierte Knochenmarkzellen mit dem Biotin-konjugierten Ratten-Anti-Maus-Antikörper-Cocktail markiert. Die Zellen werden dann mit Anti-Ratten-Ig-beschichteten Magnetperlen inkubiert und anschließend mit einem starken Magneten der magnetischen Erschöpfung unterzogen. Der Magnet hält die markierte magnetische Lin+-Fraktion an den Rohrwänden, während die nicht markierte nichtmagnetische Lin-negative Fraktion in einer neuen Röhre gesammelt wird. (B) Lineage-committed-Zellen können mit fluoreszierendem konjugiertem Streptavidin identifiziert werden. Typische Analyse der Abstammungsexpression in Zellen vor der magnetischen Depletion (gesamtes Knochenmark) und nach der magnetischen Depletion (Lin-Fraktion) N = 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Gating-Strategie der Zellsortierung. (A) Auswahl der Ereignisse, die lebensfähigen Einzelzellen entsprechen. (B) Auswahl der MdEP- und MKP-Bevölkerung. (i) Die Lin Neg-Population wird aus den lebensfähigen Einzelzellereignissen ausgewählt. (ii) Progenitoren, die c-kit exprimieren und mit niedriger bis keiner Expression von Sca-1- oder CD16/32-Antigen sind, werden dann ausgewählt. iii)CD9- und CD150-Expressionsniveaus definieren vier Zellpopulationen. MKp sind definiert als CD9helleCD150+ Zellen, MEP sind definiert als CD9dimCD150+. Die höhere Grenze für die CD9-Expression für die CD9dimCD150+ Population basiert auf dem maximalen CD9-Expressionsniveau für die CD150- Zellen. Zum Zwecke der Analyse wurden auch CD9dimCD150- Zellen (Vorläufer) und CD9-CD150- (Double Negative: DN) sortiert. (C) Zellsortiergatter basieren auf Fluoreszenz Minus Eins (FMO) Kontrollen. (i) FMO-Steuerung für CD9-Gatter (ii) FMO-Steuerung für CD150-Gatter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Charakterisierung der MEP- und MKp-Zellpopulationen. (A) Durchflusszytometrische Analyse der (i) CD41-Expression, (ii) CD42c-Expression und (iii) DNA-Gehalt (Hoechst33342) in den CD9+CD150dim (MEP) und CD9+CD150hellen (MKp) Zellpopulationen. (B) Quantifizierung von CFU-MK aus den sortierten Zellpopulationen. CD9-CD150- (DN), CD9+CD150- (Prog), CD9+CD150dim (MEP) und CD9+CD150helle (MKp) Zellpopulationen wurden sortiert und in Kollagengel gemäß den Anweisungen des Herstellers plattiert. (C) Quantifizierung von BFU-E aus den sortierten Zellpopulationen. CD9-CD150- (DN), CD9+CD150- (Prog), CD9+CD150dim (MEP) und CD9+CD150helle (MKp) Zellpopulationen wurden sortiert und in Methylcellulosegel gemäß den Anweisungen des Herstellers plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Differenzierungspotential von MEP und MKp. CD9-CD150-(DN), CD9+CD150-(Prog), CD9+CD150dim(MEP) und CD9+CD150helle(MKp) Zellpopulationen wurden drei Tage lang in StemSpan Medium kultiviert, ergänzt mit SCF (7,5 ng/ml), Flt-3 (5 ng/ml), IL-6 (1 ng/ml) und TPO (10 ng/ml). (A) Repräsentative Bilder wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. (B) Der Prozentsatz von CD41+CD42c+ Megakaryozyten wurde dann mittels Durchflusszytometrie bewertet. N = 3. (C) Der Ploidiosespiegel der CD41+CD42c+ Megakaryozyten wurde dann mit Hoechst mittels Durchflusszytometrie bewertet. N = 3. (D) Zellen, die an Tag 3 aus CD9-CD150-(DN), CD9+CD150-(Prog), CD9+CD150dim(MEP) und CD9+CD150hellen(MKp) Zellpopulationen hergestellt wurden, wurden in DMEM-Medium geerntet und kultiviert, ergänzt mit 50 ng/ml TPO, 10 % fetalem Kälberserum und 100 U/ml Hirudin. (i) Der Anteil der proplatletbildenden Megakaryozyten in der Kultur wurde durch mikroskopische Beobachtung bestimmt. Megakaryozyten wurden anhand ihrer Größe und/oder des Vorhandenseins von Proplaten identifiziert. N = 2. ii) Repräsentative Aufnahme eines proplatlethaltigen Megakaryozyten mittels Phasenkontrastmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die in diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Extraktion und Reinigung von Maus-MEP und MKp. Ein wichtiger Parameter bei der Optimierung des Protokolls war es, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, die mit den meisten molekularen und zellulären Assays kompatibel sind. Die allgemeine Praxis der Mausknochenentnahme für die hämatopoetische Zellextraktion besteht normalerweise darin, sowohl die Femuren als auch die Tibien jeder Maus zu ernten. Der Beckenknochen, eine weitere Quelle für hämatopoetisches Material, wird daher oft übersehen. Die Gründe dafür, den Beckenkamm nicht zu sammeln, sind die schlechten Kenntnisse der inneren Anatomie des Mausskeletts und die Tatsache, dass Benutzer klassischerweise Hinterbeine sammeln, indem sie über oder knapp über dem Femurkopf schneiden. Darüber hinaus wird oft angenommen, dass die Markzellen aufgrund des Vorhandenseins von Trabekeln, die im zentralen Teil der Tibia und des Femurs fehlen, nicht effizient aus dem Beckenkammknochen gespült würden. In diesem Protokoll werden diese beiden Bedenken angesprochen und eine standardisierte, zuverlässige und zeiteffektive Methode vorgestellt, die eine ordnungsgemäße Spülung jedes Hinterbeinknochens, einschließlich des Beckenknochens, ermöglicht. Insbesondere die Verwendung des Beckenknochens ergibt 105 ± 7 x 106 Zellen pro Maus, während die klassische Methode normalerweise 42 ± 5 x 106 Zellen ergibt. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Verringerung der Anzahl der Tiere, die erforderlich sind, um eine bestimmte Anzahl von Zielzellen zu erhalten, wodurch ethischere und kostengünstigere experimentelle Bedingungen geschaffen werden. Dieses Verfahren ist daher auch für jede Studie anwendbar, die eine Knochenmarksuspension erfordert, wie z.B. die Isolierung hämatopoetischer Stammzellen10 oder die Analyse des hämatopoetischen Vorläuferverhaltens unter halbfestenBedingungen 11.

Die Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik mit einem großen Reinheitsvorteil im Vergleich zu magnetischen Anreicherungstechniken, aber die Ausbeute der Zellsortierung für seltene Populationen kann geringer sein als für häufigere Populationen. Die magnetische Erschöpfung unerwünschter Zellen im Voraus ist daher eine nützliche Methode, um die Frequenz der interessierenden Zellen zu erhöhen. Hier weicht das magnetische Depletionsverfahren von der Empfehlung des Herstellers ab und berücksichtigt die Heterogenität in der Expression der Oberflächenmarker, die zur Entfernung der unerwünschten linienpositiven Zellen verwendet werden. Mit den typischen, einstufigen Protokollen sättigen linienpositive Zellen mit der höchsten Expression von Oberflächenmarkern die magnetischen Perlen schnell. Sie verhindern das anschließende Einfangen der verbleibenden markierten Zellen durch Konkurrenz und sterische Behinderung und reduzieren so die Erschöpfungswirksamkeit erheblich. Um dieses Problem anzugehen, wurde eine zweistufige magnetische Depletion entwickelt, die die sequentielle Entfernung aller lineage-positiven Zellen ermöglicht und somit stringente Depletionen ermöglicht, die für die Zellsortierung geeignet sind.

Ein weiterer kritischer Parameter, um eine effiziente Depletion zu erreichen, sind die entsprechenden Markierungsbedingungen der unerwünschten lineage-positiven Zellen. Die Antikörpertitration wurde daher gezielt optimiert. Die Verwendung höherer Konzentrationen von Antikörpern führt zu einem übermäßigen Rosetting der magnetischen Kügelchen und zur unspezifischen Erschöpfung von liniennegativen Zellen von Interesse. Die Verwendung von hochgereinigten MEP- und MKp-Zellpopulationen ist ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung der Megakaryopoese. Um die Mechanismen aufzuklären, die diesen Prozess steuern, untersuchte die Studie die Rolle der zellulären Mikroumgebung und zeigte, dass eine fetale Leberzellstromazellpopulation die Differenzierung von MKp10unterstützen würde. Die sortierte Population könnte auch für molekulare oder einzelzellbasierte Analysen verwendet werden. Dies wird besonders relevant sein angesichts des aufkommenden Begriffs der Megakaryozyten-voreingenommenen HSC12,13,14. Die Produktion von Megakaryozyten direkt aus der HSC-Population ohne die Erzeugung eines bipotenten Vorläufers wäre ein Notfallweg als Reaktion auf Stress13.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Monique Freund, Catherine Ziessel und Ketty für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) und von Grant ANR-17-CE14-0001-01 an Henri.de la unterstützt. Salle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21-gauge needles BD Microlance 301155
7AAD Sigma-Aldrich A9400
Antibody Gr-1-biotin eBioscience 13-5931-85 Magnetic depletion
Antibody B220-biotin eBioscience 13-0452-85 Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotin eBioscience 13-0112-85 Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotin eBioscience 13-0031-85 Magnetic depletion
Antibody CD4-biotin eBioscience 13-9766-82 Magnetic depletion
Antibody CD5-biotin eBioscience 13-0051-85 Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotin eBioscience 13-0081-85 Magnetic depletion
Antibody TER119-biotin eBioscience 13-5921-85 Magnetic depletion
Antibody CD127-biotin eBioscience 13-1271-85 Magnetic depletion
Antibody CD45-FITC eBioscience 11-0451-85 Cell sorting
Antibody CD45-PE eBioscience 12-0451-83 Cell sorting
Antibody TER119-APC eBioscience 17-5921-83 Cell sorting
Antibody CD45-PECy7 eBioscience 25-0451-82 Cell sorting
Antibody CD45-biotin eBioscience 13-0451-85 Cell sorting
Antibody CD9-FITC eBioscience 11-0091-82 Cell sorting
Antibody  c-kit-APC eBioscience 17-1171-83 Cell sorting
Antibody Sca-1-PE eBioscience 12-5981-83 Cell sorting
Antibody CD16/32-PE eBioscience 12-0161-83 Cell sorting
Antibody CD150-PECy7 eBioscience 25-1502-82 Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEM Stemcell technologies #09650
Dissection pad Fisher Scientific 10452395
DPBS Life Technologies 14190-094
Ethanol vWR Chemicals 83813.360
Forceps Euronexia P-120-AS
Glass pasteur pipette Dutscher 42011
Magnet :  DynaMag-5 Thermo Fisher Scientific 12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Thermo Fisher Scientific 11035
Megacult Stemcell technologies #04970
MethoCult SF M3436 Stemcell technologies #03436
Newborn Calf Serum Dutscher 50750-500
Red Cell Lysis solution BD Bioscience 555899
Scalpels Fisher Scientific 12308009
Scissors Euronexia C-165-ASB
Sterile 1 mL syringes BD Bioscience 303172
Sterile 15mL tubes Sarstedt 62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubes Falcon 352063
Sterile 5mL polystyrene tubes Falcon 352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer cap Falcon 352235
Sterile petri dish Falcon 353003
Streptavidin-APC-Cy7 BD Biosciences 554063 Cell sorting
Tube roller Benchmark Scientific R3005

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References

  1. Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
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  4. Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
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  7. Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
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  12. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  13. Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
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Tags

Biologie Heft 171

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 07/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern
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Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet,… More

Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. J. Vis. Exp. (171), e62498, doi:10.3791/62498 (2021).

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