Isolering av mus megakaryocyt progenitorer
Summary
Denna metod beskriver rening genom flöde cytometri av MEP och MKp från möss lårben, skenben och bäckenhålorna ben.
Abstract
Benmärg megakaryocyter är stora polyploida celler som säkerställer produktionen av blodplättar. De uppstår från hematopoetiska stamceller genom megakaryopoiesis. De sista stadierna av denna process är komplexa och klassiskt involvera bipotenta Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) och den enpotenta Megakaryocyte Progenitors (MKp). Dessa populationer föregår bildandet av äkta megakaryocyter och som sådan kan deras isolering och karakterisering möjliggöra robust och opartisk analys av megakaryocytbildning. Detta protokoll presenterar i detalj förfarandet för att samla hematopoetiska celler från mus benmärg, berikning av hematopoetiska stamceller genom magnetisk utarmning och slutligen en cell sortering strategi som ger mycket renade MEP och MKp populationer. För det första samlas benmärgsceller in från lårbenet, skenbenet och även iliaca-krönet, ett ben som innehåller ett stort antal hematopoetiska stamceller. Användningen av iliaca crest ben ökar drastiskt det totala antalet erhållna per mus och bidrar därmed till en mer etisk användning av djur. En magnetisk härstamning utarmning optimerades med hjälp av 450 nm magnetiska pärlor vilket möjliggör en mycket effektiv cell sortering efter flöde cytometri. Slutligen presenterar protokollet märknings- och gatingstrategin för sortering av de två högt renade megakaryocytprogenitorpopulationerna: MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9dim) och MKp (Lin– Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9bright ). Denna teknik är lätt att implementera och ger tillräckligt cellulärt material för att utföra i) molekylär karakterisering för en djupare kunskap om deras identitet och biologi, ii) in vitro differentieringsanalyser, som kommer att ge en bättre förståelse för mekanismerna för mognad av megakaryocyter, eller iii) in vitro-modeller av interaktion med deras mikromiljö.
Introduction
Blodplättar produceras av megakaryocyter. Dessa stora polyploida celler finns i benmärgen och som för alla blodkroppar härrör de från hematopoetiska stamceller (HSC)1. Den klassiska produktionsvägen för megakaryocyter i benmärgen härstammar från HSC och involverar generering av olika föregångare som gradvis begränsar deras differentieringspotential2. Den första föregångaren som undertecknar åtagandet för den megakaryocytiska härstamningen är Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), en bipotent stamfader som kan producera både erytroidceller och megakaryocyter3,4,5. Parlamentsledamoten producerar sedan en enpåtagen föregångare/föregångare (MKp) som kommer att differentieras till en mogen megakaryocyt som kan producera trombocyter. De mekanismer som är involverade i genereringen av dessa föregångare, liksom deras differentiering och mognad i megakaryocyter är komplexa och endast delvis förstådda. Dessutom är det fortfarande oklart om europaparlamentets befolkning är heterogen när det gäller differentieringspotential och den inneboende engagemangsnivån för dessa celler. För att dechiffrera dessa processer är det viktigt att få (eller ha tillgång till) renade populationer av parlamentsledamot och MKp för fina molekylära och encelliga analyser.
Flera studier har visat särskilda kombinationer av cellytans markörer för identifiering av stamceller som är engagerade i den megakaryocytiska härstamningen i musen6,7,8. Från dessa utformades en metod som möjliggör rening av parlamentsledamot och MKp från möss. Denna metod optimerades för att erhålla celler i tillräckligt antal och kvalitet för ett stort antal analyser. Med etiska överväganden i åtanke, och för att minimera antalet djur som deltar i experimenten, framkallade vi att skörda benmärgen från lårbenet och skenbenet, och även från iliaca crest. Detta ben innehåller en hög frekvens och antal hematopoetiska stamceller och skadas för det mesta under lång benskörd. Presenteras här är en detaljerad metod för tillförlitlig insamling av detta ben.
Det andra optimeringskriterierna är att producera högt renade cellpopulationer. Fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) är en valfri metod för att erhålla renade populationer av celler av intresse. Låga utbyten uppnås dock när cellpopulationen av intresse är mycket sällsynt. Anrikningsförfaranden är därför nödvändiga. I detta protokoll valdes en negativ urvalsprocedur med hjälp av magnetiska pärlor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs i detta dokument möjliggör extraktion och rening av mus mep och MKp. En viktig parameter i optimeringen av protokollet var att få tillräckligt antal celler som skulle vara kompatibla med de flesta molekylär- och cellbaserade analyser. Den allmänna praxisen för musben insamling för hematopoetisk cell extraktion består vanligtvis i att skörda både lårbenet och skenbenet i varje mus. Bäckenbenet, en annan källa till hematopoetetiskt material, förbises därför ofta. Anledningen till att i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Monique Freund, Catherine Ziessel och Ketty för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) och av Grant ANR-17-CE14-0001-01 till Henri.de la. Salle.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
References
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
- Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
- Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
- Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
- Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
- Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).
