Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers
Summary
Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia’s en bekkenbotten.
Abstract
Beenmerg megakaryocyten zijn grote polyploïde cellen die zorgen voor de productie van bloedplaatjes. Ze ontstaan uit hematopoëtische stamcellen door megakaryopoiese. De laatste stadia van dit proces zijn complex en omvatten klassiek de bipotente Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) en de unipotente Megakaryocyte Progenitors (MKp). Deze populaties gaan vooraf aan de vorming van bonafide megakaryocyten en als zodanig zou hun isolatie en karakterisering de robuuste en onbevooroordeelde analyse van megakaryocytenvorming mogelijk kunnen maken. Dit protocol presenteert in detail de procedure om hematopoëtische cellen uit het beenmerg van muizen te verzamelen, de verrijking van hematopoëtische voorlopercellen door magnetische depletie en ten slotte een celsorteerstrategie die sterk gezuiverde MEP- en MKp-populaties oplevert. Eerst worden beenmergcellen verzameld uit het dijbeen, het scheenbeen en ook de iliacale kam, een bot dat een groot aantal hematopoëtische voorlopers bevat. Het gebruik van iliacale kambotten verhoogt het totale celaantal per muis drastisch en draagt zo bij aan een ethischer gebruik van dieren. Een magnetische afstammingsdepletie werd geoptimaliseerd met behulp van 450 nm magnetische kralen die een zeer efficiënte celsortering door flowcytometrie mogelijk maakten. Ten slotte presenteert het protocol de etiketterings- en gatingstrategie voor het sorteren van de twee sterk gezuiverde megakaryocytenvoorloperpopulaties: MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9dim) en MKp (Lin– Sca-1–c-Kit+CD16/32–CD150+CD9bright ). Deze techniek is eenvoudig te implementeren en biedt voldoende cellulair materiaal om i) moleculaire karakterisering uit te voeren voor een diepere kennis van hun identiteit en biologie, ii) in vitro differentiatietests, die een beter begrip zullen geven van de mechanismen van rijping van megakaryocyten, of iii) in vitro modellen van interactie met hun micro-omgeving.
Introduction
Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten. Deze grote polyploïde cellen bevinden zich in het beenmerg en zoals voor alle bloedcellen zijn ze afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC)1. De klassieke productieroute van megakaryocyten in het beenmerg is afkomstig van HSC en omvat de generatie van verschillende voorlopers die hun differentiatiepotentieel geleidelijk beperken2. De eerste stamvader die de verbintenis tot de megakaryocytische afstamming ondertekent, is de Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), een bipotente voorloper die zowel erytroïde cellen als megakaryocyten kan produceren3,4,5. De MEP produceert vervolgens een unipotente voorloper /precursor (MKp) die zich zal differentiëren tot een volwassen megakaryocyt die in staat is om bloedplaatjes te produceren. De mechanismen die betrokken zijn bij het genereren van deze voorlopers, evenals hun differentiatie en rijping tot megakaryocyten zijn complex en slechts gedeeltelijk begrepen. Bovendien zijn de heterogeniteit van de MEP-populatie in termen van differentiatiepotentieel en het intrinsieke betrokkenheidsniveau van deze cellen nog steeds onduidelijk. Om deze processen te ontcijferen, is het essentieel om gezuiverde populaties van MEP en MKp te verkrijgen (of er toegang toe te hebben) voor fijne moleculaire en eencellige analyses.
Verschillende studies hebben specifieke combinaties van celoppervlakmarkers aangetoond voor de identificatie van voorlopers die zich inzetten voor de megakaryocytische afstamming in de muis6,7,8. Hieruit werd een methode bedacht waarmee MEP en MKp van muizen konden worden gezuiverd. Deze methode werd geoptimaliseerd om cellen in voldoende aantal en kwaliteit te verkrijgen voor een groot aantal testen. Met ethische overwegingen in gedachten, en om het aantal dieren dat betrokken is bij de experimenten te minimaliseren, hebben we uitgelokt om het beenmerg te oogsten van het dijbeen en het scheenbeen, en ook van de iliacale kam. Dit bot bevat een hoge frequentie en aantal hematopoëtische voorlopers en wordt meestal beschadigd tijdens lange botoogst. Hier gepresenteerd is een gedetailleerde methode voor de betrouwbare verzameling van dit bot.
Het tweede criterium van optimalisatie is het produceren van sterk gezuiverde celpopulaties. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) is een methode bij uitstek om gezuiverde populaties van cellen van belang te verkrijgen. Lage opbrengsten worden echter bereikt wanneer de celpopulatie van belang zeer zeldzaam is. Verrijkingsprocedures zijn dus noodzakelijk. In dit protocol is gekozen voor een negatieve selectieprocedure met behulp van magnetische kralen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die in dit artikel wordt beschreven, maakt de extractie en zuivering van muis MEP en MKp mogelijk. Een belangrijke parameter in de optimalisatie van het protocol was het verkrijgen van voldoende cellen die compatibel zouden zijn met de meeste moleculaire en cellulaire assays. De algemene praktijk van het verzamelen van muizenbotten voor hematopoëtische celextractie bestaat meestal uit het oogsten van zowel de dijbenen als de tibia’s van elke muis. Het bekkenbot, een andere bron van hematopoëtisch materiaal, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Monique Freund, Catherine Ziessel en Ketty bedanken voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), en door Grant ANR-17-CE14-0001-01 to Henri.de la. Salle.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
References
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
- Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
- Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
- Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
- Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
- Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).
