Dinamica di formazione dei proplatelet degli espianti di midollo osseo fresco del topo
Summary
Qui, descriviamo in dettaglio il metodo di espianto del midollo osseo, dalla preparazione del campione all’analisi microscopica del vetrino, per valutare la capacità dei megacariociti che si sono differenziati nel loro ambiente fisiologico di formare proplatelet.
Abstract
L’ultimo stadio della megacariopoiesi porta a estensioni citoplasmatiche da megacariociti maturi, i cosiddetti proplatelets. Molto è stato appreso sulla formazione di proplatelet utilizzando megacariociti differenziati in vitro; tuttavia, vi è una crescente evidenza che i sistemi di coltura convenzionali non ricapitolano fedelmente il processo di differenziazione / maturazione che avviene all’interno del midollo osseo. In questo manoscritto, presentiamo un metodo di espianto inizialmente descritto nel 1956 da Thiéry e Bessis per visualizzare i megacariociti che sono maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così potenziali artefatti e interpretazioni errate. I midollo osseo fresco vengono raccolti lavando i femori dei topi, tagliati in sezioni trasversali di 0,5 mm e posti in una camera di incubazione a 37 °C contenente un tampone fisiologico. I megacariociti diventano gradualmente visibili alla periferia dell’espianto e vengono osservati fino a 6 ore sotto un microscopio invertito accoppiato a una videocamera. Nel corso del tempo, i megacariociti cambiano forma, con alcune cellule che hanno una forma sferica e altre che sviluppano estensioni spesse o estendono molte proplatelet sottili con un’ampia ramificazione. Vengono effettuate indagini sia qualitative che quantitative. Questo metodo ha il vantaggio di essere semplice, riproducibile e veloce in quanto sono presenti numerosi megacariociti, e classicamente la metà di essi forma proplatelet in 6 ore rispetto ai 4 giorni per i megacariociti di topo in coltura. Oltre allo studio dei topi mutanti, un’applicazione interessante di questo metodo è la semplice valutazione degli agenti farmacologici sul processo di estensione del proplatelet, senza interferire con il processo di differenziazione che può verificarsi nelle colture.
Introduction
La tecnica di espianto del midollo osseo è stata sviluppata per la prima volta da Thiéry e Bessis nel 1956 per descrivere la formazione di estensioni citoplasmatiche dei megacariociti di ratto come un evento iniziale nella formazione piastrinica1. Utilizzando il contrasto di fase e le tecniche cinematografiche, questi autori hanno caratterizzato la trasformazione di megacariociti rotondi maturi in cellule trombocitogeniche “simili a calamari” con estensioni citoplasmatiche che mostrano movimenti dinamici di allungamento e contrazione. Queste braccia diventano progressivamente più sottili fino a diventare filiformi con piccoli gonfiori lungo le braccia e sulle punte. Questi tipici allungamenti dei megacariociti, ottenuti in vitro e in mezzi liquidi, hanno alcune somiglianze con le piastrine osservate nel midollo osseo fisso, dove i megacariociti sporgono lunghe estensioni attraverso le pareti sinusoidi nella circolazione sanguigna2,3. La scoperta e la clonazione del TPO nel 1994, ha permesso di differenziare i megacariociti in coltura in grado di formare estensioni di proplatelet simili a quelle descritte negli espianti di midollo osseo4,5,6. Tuttavia, la maturazione dei megacariociti è molto meno efficiente in condizioni di coltura, in particolare la vasta rete di membrane interne di megacariociti maturi del midollo osseo è sottosviluppata nei megacariociti in coltura, ostacolando gli studi sui meccanismi della biogenesi piastrinica7,8.
Descriviamo qui il modello di espianto del midollo osseo, basato su Thiéry e Bessis, per seguire in tempo reale la formazione di proplatelet di megacariociti di topo, che sono completamente maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così possibili artefatti in vitro e interpretazioni errate. I risultati ottenuti in topi adulti wild-type sono presentati per illustrare la capacità dei megacariociti di estendere i proplatelet, la loro morfologia e la complessità dei proplatelet. Introduciamo anche una strategia di quantificazione rapida per la convalida della qualità per garantire l’accuratezza e la robustezza dei dati durante il processo di registrazione dei megacariociti. Il protocollo qui presentato è la versione più recente del metodo pubblicato come libro capitolo precedentemente9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo in vitro semplice e a basso costo per valutare l’efficienza dei megacariociti per estendere i proplatelet che sono cresciuti nel midollo osseo. Il modello di espianto del midollo osseo per il topo ha quattro vantaggi principali. In primo luogo, non sono richieste competenze tecniche avanzate. In secondo luogo, il tempo necessario per ottenere proplatelet che estendono i megacariociti è piuttosto breve, solo 6 ore per il metodo di espianto, rispetto a un minimo di 4 giorni per un metodo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 e ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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