Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten
Summary
Hier beschreiben wir die Knochenmark-Explantationsmethode, von der Probenvorbereitung bis zur mikroskopischen Objektträgeranalyse, um die Fähigkeit von Megakaryozyten, die sich in ihrer physiologischen Umgebung differenziert haben, zu bewerten, Proplatelette zu bilden.
Abstract
Das letzte Stadium der Megakaryopoese führt zu zytoplasmatischen Erweiterungen aus reifen Megakaryozyten, den sogenannten Proplaten. Es wurde viel über die Proplatbildung unter Verwendung von in vitro-differenziertenMegakaryozyten gelernt; Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass herkömmliche Kultursysteme den Differenzierungs- / Reifungsprozess, der im Knochenmark stattfindet, nicht getreu rekapitulieren. In diesem Manuskript stellen wir eine explantierte Methode vor, die ursprünglich 1956 von Thiéry und Bessis beschrieben wurde, um Megakaryozyten zu visualisieren, die in ihrer natürlichen Umgebung gereift sind, wodurch potenzielle Artefakte und Fehlinterpretationen umgangen werden. Frische Knochenmarke werden durch Spülen der Oberschenkelknochen von Mäusen gesammelt, in 0,5 mm Querschnitte geschnitten und in eine Inkubationskammer bei 37 °C gegeben, die einen physiologischen Puffer enthält. Megakaryozyten werden allmählich an der explantaten Peripherie sichtbar und werden bis zu 6 Stunden unter einem inversen Mikroskop in Verbindung mit einer Videokamera beobachtet. Im Laufe der Zeit ändern Megakaryozyten ihre Form, wobei einige Zellen eine kugelförmige Form haben und andere dicke Erweiterungen entwickeln oder viele dünne Proplateletten mit ausgedehnter Verzweigung verlängern. Es werden sowohl qualitative als auch quantitative Untersuchungen durchgeführt. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, reproduzierbar und schnell ist, da zahlreiche Megakaryozyten vorhanden sind, und klassischerweise bildet die Hälfte von ihnen Proplatelette in 6 Stunden im Vergleich zu 4 Tagen für kultivierte Maus-Megakaryozyten. Neben der Untersuchung von mutierten Mäusen ist eine interessante Anwendung dieser Methode die einfache Bewertung der pharmakologischen Wirkstoffe auf dem Proplatlet-Erweiterungsprozess, ohne den Differenzierungsprozess, der in Kulturen auftreten kann, zu stören.
Introduction
Die Knochenmark-Explantationstechnik wurde erstmals 1956 von Thiéry und Bessis entwickelt, um die Bildung von zytoplasmatischen Erweiterungen von Megakaryozyten bei Ratten als erstes Ereignis bei der Thrombozytenbildung zu beschreiben1. Mit Hilfe von Phasenkontrast und kinematografischen Techniken charakterisierten diese Autoren die Umwandlung reifer runder Megakaryozyten in “tintenfischartige” thrombozytogene Zellen mit zytoplasmatischen Erweiterungen, die dynamische Bewegungen der Dehnung und Kontraktion zeigen. Diese Arme werden zunehmend dünner, bis sie mit kleinen Schwellungen entlang der Arme und an den Spitzen filiform werden. Diese typischen Megakaryozytendehnungen, die in vitro und in flüssigen Medien erhalten werden, weisen bestimmte Ähnlichkeiten mit Blutplättchen auf, die im festsitzenden Knochenmark beobachtet wurden, wo Megakaryozyten lange Ausdehnungen durch die Sinuswände in den Blutkreislauf ragen2,3. Die Entdeckung und Klonierung von TPO im Jahr 1994 ermöglichte es, Megakaryozyten in Kultur zu differenzieren, die in der Lage sind, Proplatleterweiterungen zu bilden, die denen ähneln, die in den Knochenmark-Explantaten4,5,6beschrieben sind. Die Megakaryozytenreifung ist jedoch unter Kulturbedingungen weit weniger effizient, insbesondere das ausgedehnte interne Membrannetzwerk von knochenmarkgereiften Megakaryozyten ist in kultivierten Megakaryozyten unterentwickelt, was Studien über die Mechanismen der Thrombozytenbiogenese behindert7,8.
Wir beschreiben hier das Knochenmark-Explantatmodell, das auf Thiéry und Bessis basiert, um in Echtzeit die Proplatletbildung von Maus-Megakaryozyten zu verfolgen, die in ihrer nativen Umgebung vollständig gereift sind und so mögliche In-vitro-Artefakte und Fehlinterpretationen umgehen. Ergebnisse, die an erwachsenen Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden, werden vorgestellt, um die Fähigkeit von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, ihre Morphologie und die Komplexität von Proplaten zu veranschaulichen. Wir führen auch eine schnelle Quantifizierungsstrategie für die Qualitätsvalidierung ein, um die Genauigkeit und Robustheit der Daten während des Megakaryozyten-Aufzeichnungsprozesses sicherzustellen. Das hier vorgestellte Protokoll ist die neueste Version der Methode, die als Buch kapitel zuvor9veröffentlicht wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige In-vitro-Methode zur Bewertung der Effizienz von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, die im Knochenmark gewachsen sind. Das Knochenmark-Explantat-Modell für Die Maus hat vier Hauptvorteile. Erstens sind keine fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten erforderlich. Zweitens ist die Zeit, die benötigt wird, um Megakaryozyten-verlängernde Proplatelets zu erhalten, ziemlich kurz, nur 6 Stunden für die Explantat-Methode, verglichen mit einem Minimu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 und ANR-18-CE14-0037 unterstützt.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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