Fare Taze Kemik İliği Eksplantlarının Proplatelet Formasyon Dinamikleri
Summary
Burada, fizyolojik ortamlarında farklılaşmış megakaryositlerin proplatlet oluşturma yeteneğini değerlendirmek için numune hazırlamadan mikroskobik slayt analizine kadar kemik iliği eksplant yöntemini detaylandırıyoruz.
Abstract
Megakaryopoezisin son aşaması, proplateletler olarak adlandırılan olgun megakaryositlerden sitoplazmik uzantılara yol açar. In vitro-farklılaştırılmışmegakaryositler kullanılarak proplatlet oluşumu hakkında çok şey öğrenilmiştir; bununla birlikte, geleneksel kültür sistemlerinin kemik iliğinin içinde gerçekleşen farklılaşma/olgunlaşma sürecini sadık bir şekilde geri almadığına dair artan bir kanıt vardır. Bu yazıda, thiéry ve Bessis tarafından 1956 yılında, kendi çevrelerinde olgunlaşmış megakaryositleri görselleştirmek, böylece potansiyel eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için açık bir yöntem sunuyoruz. Taze kemik ilikleri, farelerin uyluklarının yıkanmasıyla toplanır, 0,5 mm kesitler halinde dilimlenir ve fizyolojik tampon içeren 37 °C’de bir kuluçka odasına yerleştirilir. Megakaryositler eksiz çevrede yavaş yavaş görünür hale gelir ve bir video kameraya bağlı ters bir mikroskop altında 6 saate kadar gözlenir. Zamanla, megakaryositler şekillerini değiştirir, bazı hücreler küresel bir forma sahip ve diğerleri kalın uzantılar geliştirir veya birçok ince proplatlet geniş dallanma ile genişletir. Hem nitel hem de nicel araştırmalar yapılmaktadır. Bu yöntem, çok sayıda megakaryosit mevcut olduğu için basit, tekrarlanabilir ve hızlı olma avantajına sahiptir ve klasik olarak yarısı, kültürlü fare megakaryositleri için 4 güne kıyasla 6 saatte proplatelet oluşturur. Mutant farelerin çalışmasına ek olarak, bu yöntemin ilginç bir uygulaması, farmakolojik ajanların kültürlerde oluşabilecek farklılaşma sürecine müdahale etmeden proplatelet uzatma işlemi üzerinde basit bir şekilde değerlendirilmesidir.
Introduction
Kemik iliği eksplant tekniği ilk olarak 1956 yılında Thiéry ve Bessis tarafından trombosit oluşumunda ilk olay olarak sıçan megakaryosit sitoplazmik uzantılarının oluşumunu tanımlamak için geliştirilmiştir1. Faz kontrastı ve sinematografik teknikleri kullanan bu yazarlar, olgun yuvarlak megakaryositlerin dinamik uzama ve daralma hareketlerini gösteren sitoplazmik uzantılı “kalamar benzeri” trombositojenik hücrelere dönüşümünü karakterize ettiler. Bu kollar, kollar boyunca ve uçlarda küçük şişliklerle filiform olana kadar giderek daha ince hale gelir. İn vitro ve sıvı ortamda elde edilen bu tipik megakaryosit uzamaları, megakaryositlerin sinüzoid duvarlardan kan dolaşımına uzun uzantılar gösterdiği sabit kemik iliğinde gözlenen trombositlerle belirli benzerliklere sahiptir2,3. 1994 yılında TPO’nun keşfi ve klonlaması, kemik iliği eksplantlarında açıklananlara benzeyen proplatelet uzantıları oluşturabilen kültürdeki megakaryositlerin ayırt edilmesine izin verildi4,5,6. Bununla birlikte, megakaryosit olgunlaşması kültür koşullarında çok daha az verimlidir, özellikle kemik iliği olgunlaşmış megakaryositlerin geniş iç zar ağı kültürlü megakaryositlerde az gelişmiştir, trombosit biyogenez mekanizmaları üzerindeki çalışmaları engeller7,8.
Thiéry ve Bessis’e dayanan kemik iliği eksplant modelini, kendi ortamlarında tamamen olgunlaşmış fare megakaryositlerinin gerçek zamanlı proplatlet oluşumunda takip etmek, böylece olası in vitro eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için detaylandırırız. Vahşi tip yetişkin farelerde elde edilen sonuçlar, megakaryositlerin proplateletleri genişletme yeteneğini, morfolojilerini ve proplateletlerin karmaşıklığını göstermek için sunulmuştur. Ayrıca megakaryosit kayıt sürecinde veri doğruluğu ve sağlamlığı sağlamak için kalite doğrulaması için hızlı bir niceleme stratejisi sunuyoruz. Burada sunulan protokol, daha önce kitap bölümü olarak yayınlanan yöntemin en son sürümüdür9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, kemik iliğinde yetişen proplateletleri genişletmek için megakaryositlerin verimliliğini değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. Fare için kemik iliği eksplant modelinin dört ana avantajı vardır. İlk olarak, gelişmiş teknik becerilere gerek yoktur. İkincisi, megakaryosit uzatıcı proplateletler elde etmek için gereken süre oldukça kısadır, eksplant yöntemi için sadece 6 saattir, fare atalarından başlayan geleneksel bir kültür yönte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert’e teknik yardım için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 ve ANR-18-CE14-0037 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
