Proplatelet formasjonsdynamikk av mus frisk benmarg explants
Summary
Her beskriver vi benmargseksekale metoder, fra prøvepreparering til mikroskopisk lysbildeanalyse, for å evaluere evnen til megakaryocytter som har differensiert i deres fysiologiske miljø til å danne proplatelets.
Abstract
Den siste fasen av megakaryopoiesis fører til cytoplasmatiske utvidelser fra modne megakaryocytter, de såkalte proplatelets. Mye har blitt lært om proplateletformasjonen ved hjelp av in vitro-differensierte megakaryocytter; Det er imidlertid et økende bevis på at konvensjonelle kultursystemer ikke trofast rekapitulerer differensierings- / modningsprosessen som foregår inne i benmargen. I dette manuskriptet presenterer vi en explant-metode som opprinnelig ble beskrevet i 1956 av Thiéry og Bessis for å visualisere megakaryocytter som har modnet i sitt opprinnelige miljø, og dermed omgå potensielle gjenstander og feiltolkninger. Friske benmarger samles ved å skylle lårbenene til mus, skivet i 0,5 mm tverrsnitt, og plasseres i et inkubasjonskammer ved 37 °C som inneholder en fysiologisk buffer. Megakaryocytter blir gradvis synlige i den utplantede periferien og observeres opptil 6 timer under et invertert mikroskop koblet til et videokamera. Over tid endrer megakaryocytter sin form, med noen celler som har en sfærisk form og andre utvikler tykke utvidelser eller utvider mange tynne proplatelets med omfattende forgrening. Både kvalitative og kvantitative undersøkelser utføres. Denne metoden har fordelen av å være enkel, reproduserbar og rask som mange megakaryocytter er til stede, og klassisk halvparten av dem danner proplatelets på 6 timer sammenlignet med 4 dager for dyrkede mus megakaryocytter. I tillegg til studiet av mutante mus er en interessant anvendelse av denne metoden den enkle evalueringen av farmakologiske midler på proplateletforlengelsesprosessen, uten å forstyrre differensieringsprosessen som kan oppstå i kulturer.
Introduction
Benmargsutvisningsteknikken ble først utviklet av Thiéry og Bessis i 1956 for å beskrive dannelsen av rotte megakaryocytt cytoplasmatiske utvidelser som en innledende hendelse i blodplateformasjon1. Ved hjelp av fasekontrast og kinematografiske teknikker karakteriserte disse forfatterne transformasjonen av modne runde megakaryocytter til “blekksprutlignende” trombocytogene celler med cytoplasmatiske utvidelser som viser dynamiske bevegelser av forlengelse og sammentrekning. Disse armene blir gradvis tynnere til de blir filiform med små hevelser langs armene og på spissene. Disse typiske megakaryocyttforlengelsene, oppnådd in vitro og i flytende medier, har visse likheter med blodplater observert i fast benmarg, hvor megakaryocytter stikker lange forlengelser gjennom bihuleveggene inn i blodsirkulasjonen2,3. Oppdagelsen og kloningen av TPO i 1994, fikk lov til å skille megakaryocytter i kultur i stand til å danne proplatelet utvidelser som ligner de som er beskrevet i benmarg explants4,5,6. Imidlertid er megakaryocyttmodning langt mindre effektiv i kulturforhold, spesielt det omfattende indre membrannettverket av benmarg modnet megakaryocytter er underutviklet i dyrkede megakaryocytter, noe som hemmer studier på mekanismene for blodplatebiogenese7,8.
Vi detaljerer her benmargen explant modell, basert på Thiéry og Bessis, å følge i sanntid proplatelet dannelse av mus megakaryocytter, som har fullstendig modnet i sitt opprinnelige miljø, og dermed omgå mulige in vitro artefakter og feiltolkninger. Resultater oppnådd i villtype voksne mus presenteres for å illustrere megakaryocyttens evne til å utvide proplater, deres morfologi og kompleksiteten til proplatelets. Vi introduserer også en rask kvantifiseringsstrategi for kvalitetsvalidering for å sikre datanøyaktighet og robusthet under megakaryocyttopptaksprosessen. Protokollen som presenteres her, er den nyeste versjonen av metoden som ble publisert som et bokkapittel tidligere9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en enkel og rimelig in vitro-metode for å evaluere effektiviteten til megakaryocytter for å utvide proplater som har vokst i benmargen. Benmargens utvisningsmodell for mus har fire hovedfordeler. For det første er det ingen avanserte tekniske ferdigheter som kreves. For det andre er tiden som trengs for å oppnå megakaryocyttforlengende proplatelets ganske kort, bare 6 timer for explant-metoden, sammenlignet med minst 4 dager for en konvensjonell kulturmetode som starter fra museforfedre. Fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert for teknisk assistanse. Dette arbeidet har blitt støttet av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 og ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
