Modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose
Summary
Hier beschreven is het fototrombotische beroertemodel, waarbij een beroerte wordt geproduceerd door de intacte schedel door permanente microvasculaire occlusie op te wekken met behulp van laserverlichting na toediening van een lichtgevoelige kleurstof.
Abstract
Beroerte is een belangrijke doodsoorzaak en verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen. Ondanks uitgebreid onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën, blijven er beperkte therapeutische opties voor beroertepatiënten. Daarom is meer onderzoek nodig voor pathofysiologische trajecten zoals post-beroerte ontsteking, angiogenese, neuronale plasticiteit en regeneratie. Gezien het onvermogen van in vitro modellen om de complexiteit van de hersenen te reproduceren, zijn experimentele beroertemodellen essentieel voor de analyse en daaropvolgende evaluatie van nieuwe medicijndoelen voor deze mechanismen. Bovendien zijn gedetailleerde gestandaardiseerde modellen voor alle procedures dringend nodig om de zogenaamde replicatiecrisis te overwinnen. Als een inspanning binnen het immunostroke onderzoeksconsortium wordt een gestandaardiseerd fototrombotisch muismodel beschreven met behulp van een intraperitoneale injectie van Rose Bengal en de verlichting van de intacte schedel met een 561 nm-laser. Dit model maakt de prestaties van beroerte bij muizen mogelijk met toewijzing aan elk corticale gebied van de hersenen zonder invasieve chirurgie; dus, waardoor de studie van beroerte in verschillende gebieden van de hersenen mogelijk is. In deze video worden de chirurgische methoden van beroerte-inductie in het fototrombotische model samen met histologische analyse gedemonstreerd.
Introduction
Ischemische beroerte blijft een belangrijkste doodsoorzaak en verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen in de 21e eeuw goed voor ongeveer 2,7 miljoen sterfgevallen in 2017 wereldwijd1. Zelfs met de enorme inspanningen van de wetenschappelijke gemeenschap zijn er weinig behandelingen beschikbaar. Bovendien zijn deze reeds beperkte opties met zulke hoge uitsluitingscriteria niet toegankelijk voor veel patiënten, wat resulteert in een dringende behoefte aan nieuwe behandelingen om het functionele herstel na een beroerte te verbeteren.
Gezien de onbekwaamheid van in vitro modellen om de complexe interacties van de hersenen te repliceren, zijn diermodellen essentieel voor preklinisch beroerteonderzoek. Muizen zijn het meest gebruikte diermodel op het gebied van beroerteonderzoek. De meeste van deze muismodellen zijn gericht op het induceren van infarcten door het blokkeren van de bloedstroom in de middelste cerebrale slagader (MCA), omdat de meerderheid van de menselijke beroerte laesies zich in het MCA-gebiedbevinden 2. Hoewel deze modellen de laesies van menselijke beroertes beter samenvatten, omvatten ze geconvuleerde operaties met een hoge variabiliteit van het infarctvolume.
Sinds Rosenblum en El-Sabban’s voorstel van het fototrombotische model in 19773, en later de toepassing van dit model op ratten Watson et al.4, is het op grote schaal gebruikt in ischemisch beroerteonderzoek5,6. Het fototrombotische beroertemodel induceert een lokaal en gedefinieerd corticale infarct als gevolg van de fotoactivatie van een lichtgevoelige kleurstof die eerder in de bloedstroom werd geïnjecteerd. Dit veroorzaakt lokale trombose van de vaten in de gebieden die aan licht worden blootgesteld. Kortom, bij blootstelling aan licht van de geïnjecteerde lichtgevoelige kleurstof wordt gelokaliseerd oxidatief letsel van het endotheelcelmembraan geïnduceerd, wat leidt tot trombocytenaggregatie en trombusvorming, gevolgd door lokale verstoring van de cerebrale bloedstroom7.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in de eenvoud van uitvoering en de mogelijkheid om de laesie naar het gewenste gebied te leiden. In tegenstelling tot andere experimentele beroertemodellen is kleine chirurgische expertise nodig om het fototrombotische beroertemodel uit te voeren, omdat de laesie wordt geïnduceerd door verlichting van de intacte schedel. Bovendien kunnen de goed afgebakende grenzen ( figuur 2A en figuur 5B) en de flexibiliteit om de laesie naar een specifiek hersengebied te induceren, de studie van cellulaire reacties binnen het ischemische of intacte corticale gebiedvergemakkelijken 8. Om deze redenen is deze aanpak geschikt voor de studie van cellulaire en moleculaire mechanismen van corticale plasticiteit.
In de afgelopen decennia is de groeiende bezorgdheid over het gebrek aan reproduceerbaarheid tussen onderzoeksgroepen bedacht als de zogenaamde replicatiecrisis9. Na de coördinatie van de eerste preklinische gerandomiseerde gecontroleerde multicenter studie in 201510, een voorgesteld instrument om preklinisch onderzoek11,12,13te verbeteren , werd bevestigd dat een van de oorzaken van falende reproduceerbaarheid tussen preklinische studies van onafhankelijke laboratoria het ontbreken van voldoende standaardisatie van experimentele beroertemodellen en uitkomstparameters14was . Toen het ImmunoStroke-consortium werd opgericht (https://immunostroke.de/), een samenwerking die tot doel heeft hersen-immuuninteracties te begrijpen die ten grondslag liggen aan de mechanistische principes van beroerteherstel, was de standaardisatie van alle experimentele beroertemodellen tussen elke onderzoeksgroep essentieel.
Hier wordt de gestandaardiseerde procedure beschreven voor de inductie van het fototrombotische model zoals gebruikt in het bovengenoemde onderzoeksconsortium. Kortom, een dier onderging verdoving, kreeg intraperitonaal een Rose Bengal injectie (10 μL/g) en de intacte schedel, 3 mm links van bregma, werd onmiddellijk verlicht door een 561 nm laser gedurende 20 min (Figuur 1). Bovendien wordt een gerelateerde histologische en gedragsmatige methode gerapporteerd om het resultaat van de beroerte in dit model te analyseren. Alle methoden zijn gebaseerd op standaard operationele procedures die in het laboratorium zijn ontwikkeld en gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft het experimentele beroertemodel van fototrombose door de intacte schedel te verlichten met een 561 nm laser, met een eerdere intraperitoneale injectie van Rose Bengal. Tot voor kort was het gebruik van dit model laag, maar neemt het gestaag toe.
Mortaliteit tijdens beroerte-inductie in dit model is afwezig. De totale mortaliteit van minder dan 5% ontstaat tijdens de operatie als gevolg van anesthesiologische complicaties of opoffering na het voldoen aan d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken al onze samenwerkingspartners van de Immunostroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) voor suggesties en discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse excellentiestrategie in het kader van het München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) en in het kader van de subsidies LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 en LL-112/1-1.
Materials
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
