Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Summary

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Abstract

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos. Apesar da extensa investigação para novas estratégias terapêuticas, permanecem opções terapêuticas limitadas para pacientes com AVC. Portanto, mais pesquisas são necessárias para vias fisiofisiológicas como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Dada a incapacidade de modelos in vitro para reproduzir a complexidade do cérebro, modelos experimentais de derrame são essenciais para a análise e posterior avaliação de novos alvos de drogas para esses mecanismos. Além disso, modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos são urgentemente necessários para superar a chamada crise de replicação. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa ImmunoStroke, um modelo de rato fototrombótico padronizado usando uma injeção intraperitoneal de Rose Bengala e a iluminação do crânio intacto com um laser de 561 nm é descrito. Este modelo permite o desempenho do AVC em camundongos com alocação para qualquer região cortical do cérebro sem cirurgia invasiva; assim, possibilitando o estudo do AVC em várias áreas do cérebro. Neste vídeo, são demonstrados os métodos cirúrgicos de indução de AVC no modelo fototrombótico, juntamente com a análise histológica.

Introduction

O AVC isquêmico continua sendo a principal causa de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos no século^XXI, representando aproximadamente 2,7 milhões de mortes em 2017 em todo o mundo¹. Mesmo com os imensos esforços da comunidade científica, poucos tratamentos estão disponíveis. Além disso, com critérios de exclusão tão elevados, essas opções já limitadas não são acessíveis a muitos pacientes, resultando em uma necessidade urgente de novos tratamentos para melhorar a recuperação funcional após o AVC.

Considerando a incapacidade dos modelos in vitro de replicar as interações complexas do cérebro, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. Os camundongos são o modelo animal mais usado no campo de pesquisa de derrame. A maioria desses modelos de camundongos visa induzir infartos bloqueando o fluxo sanguíneo dentro da artéria cerebral média (MCA) uma vez que a maioria das lesões de derrame humano estão localizadas no território^{mca 2}. Embora esses modelos recapitulem melhor as lesões de derrame humano, envolvem cirurgias convuladas com alta variabilidade de volume infarto.

Desde a proposta de Rosenblum e El-Sabban do modelo fototrombótico em 1977³, e mais tarde a aplicação deste modelo aos ratos Watson et al.⁴, tornou-se amplamente utilizado na pesquisa isquêmica de derrame^5,6. O modelo de derrame fototrombótico induz um infarto cortical local e definido como resultado da fotoativação de um corante sensível à luz previamente injetado no fluxo sanguíneo. Isso causa trombose local dos navios nas áreas expostas à luz. Brevemente, após a exposição à luz do corante fotossensível injetado, induzida a lesão oxidativa localizada da membrana celular endotelial é induzida, levando à agregação plaquetária e à formação de trombos, seguida pela interrupção local do fluxo sanguíneo cerebral⁷.

A principal vantagem dessa técnica reside na sua simplicidade de execução e na possibilidade de direcionar a lesão para a região desejada. Ao contrário de outros modelos experimentais de derrame, é necessário menor experiência cirúrgica para realizar o modelo de derrame fototrombótico, pois a lesão é induzida pela iluminação do crânio intacto. Além disso, as bordas bem delimitadas (Figura 2A e Figura 5B) e a flexibilidade para induzir a lesão a uma região cerebral específica podem facilitar o estudo das respostas celulares dentro da área cortical isquêmica ou intacta⁸. Por essas razões, essa abordagem é adequada para o estudo de mecanismos celulares e moleculares de plasticidade cortical.

Ao longo das últimas décadas, a crescente preocupação com a falta de reprodutibilidade entre os grupos de pesquisa foi cunhada da chamada crise de replicação⁹. Após a coordenação do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizado pré-clínico em 2015¹⁰, uma ferramenta proposta para melhorar a pesquisa pré-clínica^11,12,13, foi confirmado que uma das causas para a falha na reprodutibilidade entre estudos pré-clínicos de laboratórios independentes foi a falta de padronização suficiente de modelos experimentais de avc e parâmetros de desfecho¹⁴. Assim, quando o consórcio ImmunoStroke foi estabelecido (https://immunostroke.de/), uma colaboração que visa compreender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC, a padronização de todos os modelos experimentais de AVC entre cada grupo de pesquisa foi essencial.

Descrito aqui é o procedimento padronizado para a indução do modelo fototrombótico, conforme utilizado no consórcio de pesquisa acima mencionado. Resumidamente, um animal foi submetido a anestésicos, recebeu uma injeção de Bengala Rosa (10 μL/g) intraperitonalmente, e o crânio intacto, 3 mm restante de bregma, foi imediatamente iluminado por um laser de 561 nm por 20 min (Figura 1). Além disso, é relatado um método histológico e comportamental relacionado para analisar o desfecho do AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em laboratório.

Protocol

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Os camundongos utilizados neste estudo foram camundongos C57Bl/6J machos, de 10 a 12 semanas de idade, e despachados pela Alemanha do Rio Charles. Os animais foram alojados sob temperaturas controladas (22 °C ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e aces…

Representative Results

O modelo descrito aqui é um modelo de derrame fototrombótico pela injeção de Rose Bengala e iluminação intacta do crânio por 20 minutos, em um comprimento de onda constante de 561 nm e 25 mW de potência de saída na fibra. Embora a cirurgia fototrombótica completa dure 30 minutos, o animal é mantido sob baixa anestesia e o dano cerebral é moderado. Aproximadamente 10 minutos após a transferência para suas gaiolas, todos os animais estavam acordados, movendo-se livremente na gaiola, e interagindo com os compa…

Discussion

O protocolo apresentado descreve o modelo experimental de derrame de fototrombose iluminando o crânio intacto com um laser de 561 nm, com uma injeção intraperitoneal anterior de Rose Bengala. Até recentemente, o uso desse modelo tem sido baixo, mas está aumentando constantemente.

A mortalidade por indução de AVC neste modelo está ausente. A mortalidade geral de menos de 5% surge durante a operação devido a complicações anestesiológicas ou sacrifício após o cumprimento dos crité…

Materials

561 nm wavelenght laser	Solna	Cobolt HS-03
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100
Bepanthen pomade	Bayer	1578681
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Collimeter	Thorlabs	F240APC-A
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filter paper	Macherey-Nagel	432018
Fine Scissors	FST	15000-00
Forceps	FST	11616-15
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller	40-90-8D
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle	Perimed	PeriCam PSI HR
Mayor Scissors	FST	1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Protective glasses	Laser 2000	NIR-ZS2-38
Rose Bengal	Sigma Aldrich	198250-5G
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Stereotactic frame	Stoelting	51500U
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Xylacine	Albrecht