在本方案中,我们展示了如何使用基于免疫荧光的方法在细胞周期的S / G2阶段可视化DNA双链末端切除。
DNA损伤反应(DDR)的研究是一个复杂而重要的领域,由于使用DDR靶向药物进行癌症治疗,这一领域变得更加重要。这些靶标是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARPs),其启动各种形式的DNA修复。使用PARP抑制剂(PARPi)抑制这些酶,通过在乳腺癌1型(BRCA1),BRCA2或BRCA2(PALB2)的伴侣和定位剂的突变中赋予同源重组(HR)缺陷细胞的治疗脆弱性来实现合成致死性。
用PARPi处理的细胞积累DNA双链断裂(DSBs)。这些断裂由DNA末端切除机制处理,导致单链(ss)DNA的形成和随后的DNA修复。在BRCA1缺乏的情况下,通过DNA切除抑制剂(如53BP1和DYNLL1)的突变重新激活DNA切除,会导致PARPi耐药性。因此,能够监测 纤维素中的 DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径和开发克服PARPi耐药性的新策略至关重要。基于免疫荧光(IF)的技术允许在DNA损伤后监测整体DNA切除。该策略需要使用5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)进行长脉冲基因组DNA标记。在DNA损伤和DNA末端切除术之后,产生的单链DNA在天然条件下被抗BrdU抗体特异性检测。此外,还可以使用细胞周期标记物研究DNA切除,以区分细胞周期的各个阶段。S / G2期的细胞允许研究HR内的末端切除术,而G1细胞可用于研究非同源末端连接(NHEJ)。本文描述了这种IF方法耦合到细胞周期判别的详细方案。
DNA修复因子的调节是癌症治疗的一种不断发展的方法,特别是在DNA DSB修复缺陷的肿瘤环境中。抑制特定修复因子是用于使癌细胞对DNA损伤剂敏感的巧妙策略之一。数十年的研究导致鉴定出DNA修复基因的各种突变作为治疗策略选择的生物标志物1。因此,DNA修复领域已成为药物开发的中心,以确保广泛的治疗,从而增强个性化医疗概念。
DSB通过两种主要途径进行修复:NHEJ和HR2。NHEJ途径容易出错,快速连接两个DNA末端,几乎没有DNA末端处理,涉及蛋白激酶(DNA-PKcs),Ku70 / 80复合物,53BP1和RIF1蛋白3。相比之下,HR是由BRCA14发起的忠实机制。HR修复的一个重要步骤是DNA末端切除过程,该过程是断裂末端的降解,导致具有3′-OH末端的单链(ss)DNA。BRCA1 促进下游蛋白的募集,这些蛋白形成分离体 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1,这些蛋白参与 5′ 至 3′ DNA 切除5。
初始末端切除是通过MRE11的内切酶活性完成的,允许DNA2和EXO1核酸酶进一步处理。生成的ssDNA悬垂被复制蛋白A(RPA)快速包被,以保护它们免受进一步处理。随后,BRCA2,PALB2和BRCA1接合以介导RPA的位移和同源定向修复机制所需的RAD51核纤维的组装。NHEJ和HR的使用之间的良好平衡对于基因组完整性的最佳维护是必要的。通路的选择取决于细胞周期阶段。HR优先用于S至G2阶段,其中DNA切除处于最高水平,并且姐妹染色单体可用于确保适当的修复。
聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)是最早招募到DSB的蛋白质之一。它调节切除活性和NHEJ5,6中涉及的下游效应器的组装。在复制过程中,DNA单链断裂修复也需要PARP-17,8。由于其在DNA修复中的重要作用,PARP抑制剂(PARPi)被用作癌症疗法。在几种HR缺陷癌症中,PARPi治疗导致合成致死反应,因为HR缺陷细胞无法通过替代途径修复累积的损伤9,10。目前有四种FDA批准的PARPi:Olaparib,Rucaparib,Niriparib和Talazoparib(也称为BMN 673),用于各种乳腺癌和卵巢癌治疗11。然而,PARPi 耐药性很常见,一个潜在的原因就是通过重新获得 HR 熟练度12 而产生的。在存在辐照的情况下,PARP-1的丢失或抑制会使切除体机制失调,导致更长的ssDNA束积累13。因此,深入研究体内DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径以及随后开发治疗癌症和克服PARPi耐药性的新策略至关重要。
已经有几种方法用于检测DNA切除事件5。其中一种方法是基于IF的经典技术,允许使用抗RPA抗体在应激诱导的DSB后对切除的DNA进行间接染色和可视化。用5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)标记基因组DNA并仅检测ssDNA是对DNA切除事件的直接测量。它规避了RPA的监测,RPA涉及DNA复制等多个细胞过程。在这里描述的方法中,与BrdU一起孵育的细胞进行单个细胞周期允许BrdU掺入复制细胞DNA的一条链中。切除后,在允许仅以ssDNA形式检测BrdU的条件下进行IF染色,并使用抗BrdU抗体。这种抗体只能进入暴露的BrdU核苷酸,不会检测到那些整合到双链DNA中的核苷酸。使用荧光显微镜,切除的DNA可以以点状BrdU / ssDNA病灶的形式可视化。这些病灶的核强度可用作量化DNA损伤后切除的读数。本文逐步描述了该方法的过程,该方法可以应用于大多数哺乳动物细胞系。这种方法应该具有广泛的实用性,作为监测 纤维素中DNA末端切除的简单方法,作为概念证明。
本文描述了一种利用IF染色来测量 纤维素中DNA切除变异的方法。目前观察对DNA切除的影响的标准是通过RPA染色;然而,这是一种可能受DNA复制影响的间接方法。此前,已经描述了另一种基于BrdU掺入的DNA切除IF技术,用于对BrdU阳性和BrdU阴性细胞中产生的强度进行分类。该方法允许由于背景或线粒体染色而未进行HR的细胞被计为阳性,从而导致高BrdU强度14,<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Marie-Christine Caron出色的技术建议。这项工作得到了加拿大卫生研究院J.Y.M(CIHR FDN-388879)的资助。J.-Y.M.在DNA修复和癌症治疗方面拥有加拿大一级研究主席。J.O’S是FRQS博士生研究员,S.Y.M是FRQS博士后研究员。
Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
HeLa | ATCC | CCL-2 | |
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
Needle | |||
PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
Tweezers |