使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像评估全球DNA双链末端切除术
Summary
在本方案中，我们展示了如何使用基于免疫荧光的方法在细胞周期的S / G2阶段可视化DNA双链末端切除。
Abstract
DNA损伤反应（DDR）的研究是一个复杂而重要的领域，由于使用DDR靶向药物进行癌症治疗，这一领域变得更加重要。这些靶标是聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs），其启动各种形式的DNA修复。使用PARP抑制剂（PARPi）抑制这些酶，通过在乳腺癌1型（BRCA1），BRCA2或BRCA2（PALB2）的伴侣和定位剂的突变中赋予同源重组（HR）缺陷细胞的治疗脆弱性来实现合成致死性。
用PARPi处理的细胞积累DNA双链断裂（DSBs）。这些断裂由DNA末端切除机制处理，导致单链（ss）DNA的形成和随后的DNA修复。在BRCA1缺乏的情况下，通过DNA切除抑制剂（如53BP1和DYNLL1）的突变重新激活DNA切除，会导致PARPi耐药性。因此，能够监测 纤维素中的 DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径和开发克服PARPi耐药性的新策略至关重要。基于免疫荧光（IF）的技术允许在DNA损伤后监测整体DNA切除。该策略需要使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）进行长脉冲基因组DNA标记。在DNA损伤和DNA末端切除术之后，产生的单链DNA在天然条件下被抗BrdU抗体特异性检测。此外，还可以使用细胞周期标记物研究DNA切除，以区分细胞周期的各个阶段。S / G2期的细胞允许研究HR内的末端切除术，而G1细胞可用于研究非同源末端连接（NHEJ）。本文描述了这种IF方法耦合到细胞周期判别的详细方案。
Introduction
DNA修复因子的调节是癌症治疗的一种不断发展的方法，特别是在DNA DSB修复缺陷的肿瘤环境中。抑制特定修复因子是用于使癌细胞对DNA损伤剂敏感的巧妙策略之一。数十年的研究导致鉴定出DNA修复基因的各种突变作为治疗策略选择的生物标志物1。因此，DNA修复领域已成为药物开发的中心，以确保广泛的治疗，从而增强个性化医疗概念。
DSB通过两种主要途径进行修复：NHEJ和HR2。NHEJ途径容易出错，快速连接两个DNA末端，几乎没有DNA末端处理，涉及蛋白激酶（DNA-PKcs），Ku70 / 80复合物，53BP1和RIF1蛋白3。相比之下，HR是由BRCA14发起的忠实机制。HR修复的一个重要步骤是DNA末端切除过程，该过程是断裂末端的降解，导致具有3′-OH末端的单链（ss）DNA。BRCA1 促进下游蛋白的募集，这些蛋白形成分离体 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1，这些蛋白参与 5′ 至 3′ DNA 切除5。
初始末端切除是通过MRE11的内切酶活性完成的，允许DNA2和EXO1核酸酶进一步处理。生成的ssDNA悬垂被复制蛋白A（RPA）快速包被，以保护它们免受进一步处理。随后，BRCA2，PALB2和BRCA1接合以介导RPA的位移和同源定向修复机制所需的RAD51核纤维的组装。NHEJ和HR的使用之间的良好平衡对于基因组完整性的最佳维护是必要的。通路的选择取决于细胞周期阶段。HR优先用于S至G2阶段，其中DNA切除处于最高水平，并且姐妹染色单体可用于确保适当的修复。
聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）是最早招募到DSB的蛋白质之一。它调节切除活性和NHEJ5，6中涉及的下游效应器的组装。在复制过程中，DNA单链断裂修复也需要PARP-17，8。由于其在DNA修复中的重要作用，PARP抑制剂（PARPi）被用作癌症疗法。在几种HR缺陷癌症中，PARPi治疗导致合成致死反应，因为HR缺陷细胞无法通过替代途径修复累积的损伤9，10。目前有四种FDA批准的PARPi：Olaparib，Rucaparib，Niriparib和Talazoparib（也称为BMN 673），用于各种乳腺癌和卵巢癌治疗11。然而，PARPi 耐药性很常见，一个潜在的原因就是通过重新获得 HR 熟练度12 而产生的。在存在辐照的情况下，PARP-1的丢失或抑制会使切除体机制失调，导致更长的ssDNA束积累13。因此，深入研究体内DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径以及随后开发治疗癌症和克服PARPi耐药性的新策略至关重要。
已经有几种方法用于检测DNA切除事件5。其中一种方法是基于IF的经典技术，允许使用抗RPA抗体在应激诱导的DSB后对切除的DNA进行间接染色和可视化。用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记基因组DNA并仅检测ssDNA是对DNA切除事件的直接测量。它规避了RPA的监测，RPA涉及DNA复制等多个细胞过程。在这里描述的方法中，与BrdU一起孵育的细胞进行单个细胞周期允许BrdU掺入复制细胞DNA的一条链中。切除后，在允许仅以ssDNA形式检测BrdU的条件下进行IF染色，并使用抗BrdU抗体。这种抗体只能进入暴露的BrdU核苷酸，不会检测到那些整合到双链DNA中的核苷酸。使用荧光显微镜，切除的DNA可以以点状BrdU / ssDNA病灶的形式可视化。这些病灶的核强度可用作量化DNA损伤后切除的读数。本文逐步描述了该方法的过程，该方法可以应用于大多数哺乳动物细胞系。这种方法应该具有广泛的实用性，作为监测 纤维素中DNA末端切除的简单方法，作为概念证明。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述了一种利用IF染色来测量 纤维素中DNA切除变异的方法。目前观察对DNA切除的影响的标准是通过RPA染色;然而，这是一种可能受DNA复制影响的间接方法。此前，已经描述了另一种基于BrdU掺入的DNA切除IF技术，用于对BrdU阳性和BrdU阴性细胞中产生的强度进行分类。该方法允许由于背景或线粒体染色而未进行HR的细胞被计为阳性，从而导致高BrdU强度14，<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Marie-Christine Caron出色的技术建议。这项工作得到了加拿大卫生研究院J.Y.M（CIHR FDN-388879）的资助。J.-Y.M.在DNA修复和癌症治疗方面拥有加拿大一级研究主席。J.O’S是FRQS博士生研究员，S.Y.M是FRQS博士后研究员。
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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