सेल चक्र भेदभाव इमेजिंग के साथ युग्मित BrdU-डीएनए लेबलिंग का उपयोग कर वैश्विक डीएनए डबल स्ट्रैंड एंड लकीर का आकलन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विधि का उपयोग करके सेल चक्र के एस / जी 2 चरण के दौरान डीएनए डबल-स्ट्रैंड एंड लकीर की कल्पना कैसे करें।
Abstract
डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का अध्ययन एक जटिल और आवश्यक क्षेत्र है, जो केवल कैंसर के उपचार के लिए डीडीआर-लक्ष्यीकरण दवाओं के उपयोग के कारण अधिक महत्वपूर्ण हो गया है। ये लक्ष्य पॉली (एडीपी-राइबोस) पोलीमरेज़ (पीएआरपी) हैं, जो डीएनए मरम्मत के विभिन्न रूपों को शुरू करते हैं। PARP inhibitors (PARPi) का उपयोग करके इन एंजाइमों को बाधित करना सजातीय पुनर्संयोजन (एचआर) में एक चिकित्सीय भेद्यता प्रदान करके सिंथेटिक घातकता प्राप्त करता है – स्तन कैंसर टाइप 1 (BRCA1), BRCA2, या BRCA2 (PALB2) के साथी और स्थानीयकरण में उत्परिवर्तन के कारण कोशिकाओं की कमी।
PARPi के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSBs) जमा करती हैं। इन ब्रेकों को डीएनए एंड लकीर मशीनरी द्वारा संसाधित किया जाता है, जिससे एकल-फंसे हुए (एसएस) डीएनए और बाद में डीएनए मरम्मत का गठन होता है। एक BRCA1-कमी वाले संदर्भ में, डीएनए लकीर अवरोधकों में उत्परिवर्तन के माध्यम से डीएनए लकीर को पुनर्जीवित करना, जैसे कि 53BP1 और DYNLL1, PARPi प्रतिरोध का कारण बनता है। इसलिए, सेल्युलो में डीएनए लकीर की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए नई रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। Immunofluorescence (IF) -आधारित तकनीकें डीएनए क्षति के बाद वैश्विक डीएनए लकीर की निगरानी के लिए अनुमति देती हैं। इस रणनीति के लिए 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडिन (बीआरडीयू) के साथ लंबी नाड़ी जीनोमिक डीएनए लेबलिंग की आवश्यकता होती है। डीएनए क्षति और डीएनए अंत लकीर के बाद, परिणामी एकल-फंसे हुए डीएनए को विशेष रूप से देशी परिस्थितियों में एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। इसके अलावा, कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के बीच अंतर करने के लिए सेल चक्र मार्करों का उपयोग करके डीएनए लकीर का भी अध्ययन किया जा सकता है। एस / जी 2 चरण में कोशिकाएं एचआर के भीतर अंत लकीर के अध्ययन की अनुमति देती हैं, जबकि जी 1 कोशिकाओं का उपयोग गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस IF विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सेल चक्र भेदभाव के लिए युग्मित इस पेपर में वर्णित है।
Introduction
डीएनए मरम्मत कारकों का मॉडुलन कैंसर थेरेपी के लिए एक कभी-विकसित विधि है, विशेष रूप से डीएनए डीएसबी मरम्मत-कमी वाले ट्यूमर वातावरण में। विशिष्ट मरम्मत कारकों का निषेध डीएनए-हानिकारक एजेंटों के लिए कैंसर कोशिकाओं को संवेदनशील बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली सरल रणनीतियों में से एक है। अनुसंधान के दशकों ने चिकित्सीय रणनीति विकल्पों के लिए बायोमार्कर के रूप में डीएनए मरम्मत जीन के विभिन्न उत्परिवर्तनों की पहचान की। नतीजतन, डीएनए मरम्मत क्षेत्र व्यक्तिगत चिकित्सा अवधारणा को सशक्त बनाने के लिए उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला सुनिश्चित करने के लिए दवा के विकास के लिए एक केंद्र बन गया है।
डीएसबी की मरम्मत दो मुख्य मार्गों द्वारा की जाती है: एनएचईजे और एचआर 2। एनएचईजे मार्ग त्रुटि-प्रवण है, तेजी से दो डीएनए सिरों को बिना किसी डीएनए अंत-प्रसंस्करण के साथ लिगेटिंग करता है और इसमें प्रोटीन किनेज (डीएनए-पीकेसी), Ku70/80 कॉम्प्लेक्स, 53BP1 और RIF1 प्रोटीन 3 शामिल होते हैं। इसके विपरीत, एचआर बीआरसीए 14 द्वारा शुरू किया गया एक वफादार तंत्र है। एचआर मरम्मत में एक आवश्यक कदम डीएनए-एंड लकीर प्रक्रिया है, जो टूटे हुए सिरों की गिरावट है जो 3′-OH सिरों के साथ एकल-फंसे (एसएस) डीएनए के लिए अग्रणी है। BRCA1 डाउनस्ट्रीम प्रोटीन की भर्ती की सुविधा प्रदान करता है जो resectosome MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 बनाते हैं, जो 5 ‘से 3’ डीएनए लकीर 5 में शामिल होते हैं।
प्रारंभिक अंत-लकीर को MRE11 की एंडोन्यूक्लिएज गतिविधि के माध्यम से पूरा किया जाता है, जिससे DNA2 और EXO1 न्यूक्लिएज द्वारा आगे के प्रसंस्करण की अनुमति मिलती है। उत्पन्न ssDNA overhangs जल्दी से प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) द्वारा लेपित कर रहे हैं उन्हें आगे प्रसंस्करण से बचाने के लिए. इसके बाद, BRCA2, PALB2, और BRCA1 आरपीए के विस्थापन और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत तंत्र के लिए आवश्यक RAD51 न्यूक्लियोफिलामेंट की असेंबली की मध्यस्थता करने के लिए संलग्न हैं। जीनोमिक अखंडता के इष्टतम रखरखाव के लिए एनएचईजे और एचआर के उपयोग के बीच एक ठीक संतुलन आवश्यक है। मार्ग विकल्प सेल चक्र चरण पर निर्भर करता है। एचआर का उपयोग एस से जी 2 चरणों के दौरान प्राथमिकता से किया जाता है जिसमें डीएनए लकीर उच्चतम स्तर पर होती है, और उचित मरम्मत सुनिश्चित करने के लिए बहन क्रोमैटिड उपलब्ध होते हैं।
पॉली (ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1 (PARP-1) DSB में भर्ती किए गए शुरुआती प्रोटीनों में से एक है। यह लकीर गतिविधि और NHEJ5,6 में शामिल डाउनस्ट्रीम प्रभावकों की असेंबली दोनों को नियंत्रित करता है। PARP-1 भी प्रतिकृति 7,8 के दौरान डीएनए एकल फंसे हुए ब्रेक मरम्मत के लिए आवश्यक है। डीएनए मरम्मत में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, PARP अवरोधकों (PARPi) का उपयोग कैंसर उपचार के रूप में किया जाता है। कई एचआर-कमी वाले कैंसर में, PARPi उपचार एक वैकल्पिक मार्ग 9,10 के माध्यम से संचित क्षति की मरम्मत के लिए एचआर-कमी वाली कोशिकाओं की अक्षमता के कारण एक सिंथेटिक घातक प्रतिक्रिया की ओर जाता है। वर्तमान में चार एफडीए द्वारा अनुमोदित PARPi हैं: Olaparib, Rucaparib, Niriparib, और Talazoparib (जिसे BMN 673 भी कहा जाता है), जिनका उपयोग विभिन्न स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर के उपचार के लिए किया जाता है। हालांकि, PARPi प्रतिरोध आम है, और एक संभावित कारण मानव संसाधन प्रवीणता 12 की पुन: अधिग्रहण के माध्यम से उत्पन्न होता है। विकिरण की उपस्थिति में PARP-1 का नुकसान या निषेध resectosome मशीनरी को डिस्रेगुलेट करता है, जिससे लंबे समय तक ssDNA tracts13 का संचय होता है। इसलिए, विवो में डीएनए लकीर का एक गहन अध्ययन डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और कैंसर के इलाज के लिए नई रणनीतियों के बाद के विकास और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
डीएनए लकीर की घटनाओं का पता लगाने के लिए कई तरीकों को नियोजित किया गया है5। ऐसी ही एक विधि शास्त्रीय आईएफ-आधारित तकनीक है जो एंटी-आरपीए एंटीबॉडी का उपयोग करके तनाव-प्रेरित डीएसबी के बाद अप्रत्यक्ष धुंधला और उच्छेदित डीएनए के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देती है। 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) के साथ जीनोमिक डीएनए लेबलिंग और केवल ssDNA का पता लगाना डीएनए लकीर की घटनाओं का एक सीधा माप है। यह आरपीए की निगरानी को दरकिनार करता है, जो डीएनए प्रतिकृति जैसे कई सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है। यहां वर्णित विधि में, एक एकल सेल चक्र के लिए बीआरडीयू के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाएं बीआरडीयू को प्रतिकृति सेलुलर डीएनए के एक स्ट्रैंड में शामिल करने की अनुमति देती हैं। लकीर के बाद, IF धुंधला उन परिस्थितियों के तहत किया जाता है जिनमें BrdU का पता लगाने की अनुमति केवल ssDNA रूप में होती है, जिसमें एंटी-BrdU एंटीबॉडी के उपयोग के साथ। यह एंटीबॉडी केवल उजागर बीआरडीयू न्यूक्लियोटाइड्स तक पहुंच सकती है और डबल-फंसे डीएनए में एकीकृत लोगों का पता नहीं लगाएगी। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, उच्छेदित डीएनए को पंक्टेट बीआरडीयू / एसएसडीएनए फोकी के रूप में देखा जा सकता है। डीएनए क्षति के बाद लकीर को मापने के लिए इन फोकी की परमाणु तीव्रता का उपयोग रीडआउट के रूप में किया जा सकता है। यह पेपर इस विधि की प्रक्रियाओं को चरण-दर-चरण वर्णन करता है, जिसे अधिकांश स्तनधारी सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है। यह विधि अवधारणा के प्रमाण के रूप में सेल्युलो में डीएनए अंत लकीर की निगरानी के एक सरल तरीके के रूप में व्यापक उपयोगिता की होनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो सेल्युलो में डीएनए लकीर में भिन्नताओं को मापने के लिए आईएफ स्टेनिंग का उपयोग करता है। डीएनए लकीर पर प्रभाव को देखने के लिए वर्तमान मानक आरपीए धुंधला के माध्यम …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सलाह के लिए मैरी-क्रिस्टीन कैरन को धन्यवाद देते हैं। यह काम कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान जेवाई.M (CIHR FDN-388879) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित है। J.-Y.M डीएनए मरम्मत और कैंसर चिकित्सीय में एक टियर 1 कनाडा अनुसंधान कुर्सी रखती है। J.O’S एक FRQS पीएचडी छात्र साथी है, और S.Y.M एक FRQS पोस्टडॉक्टोरल फेलो है।
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
