Vurdering av global DNA Double-Strand End Resection ved hjelp av BrdU-DNA-merking kombinert med cell cycle diskriminering imaging
Summary
I den nåværende protokollen demonstrerer vi hvordan man visualiserer DNA dobbeltstrenget end reseksjon under S / G2-fasen av cellesyklusen ved hjelp av en immunfluorescence-basert metode.
Abstract
Studien av DNA-skaderesponsen (DDR) er et komplekst og essensielt felt, som bare har blitt viktigere på grunn av bruk av DDR-målrettede legemidler til kreftbehandling. Disse målene er poly(ADP-ribose) polymeraser (PARPer), som initierer ulike former for DNA-reparasjon. Hemming av disse enzymene ved hjelp av PARP-hemmere (PARPi) oppnår syntetisk dødelighet ved å gi en terapeutisk sårbarhet i homolog rekombinasjon (HR)-mangelfulle celler på grunn av mutasjoner i brystkreft type 1 (BRCA1), BRCA2, eller partner og lokalisering av BRCA2 (PALB2).
Celler behandlet med PARPi akkumulerer DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSBer). Disse pausene behandles av DNA-end reseksjonsmaskineri, noe som fører til dannelse av enkeltstrenget (ss) DNA og påfølgende DNA-reparasjon. I en BRCA1-mangelfull kontekst forårsaker gjenoppfriskning av DNA-reseksjon gjennom mutasjoner i DNA-reseksjonshemmere, som 53BP1 og DYNLL1, PARPi-resistens. Derfor er det viktig å kunne overvåke DNA-reseksjon i cellulo for en klarere forståelse av DNA-reparasjonsveiene og utviklingen av nye strategier for å overvinne PARPi-motstand. Immunfluorescens (IF)-baserte teknikker muliggjør overvåking av global DNA-reseksjon etter DNA-skade. Denne strategien krever genomisk DNA-merking med lang puls med 5-bromo-2′-deoksyuridin (BrdU). Etter DNA-skade og DNA-end reseksjon, blir det resulterende enkeltstrengede DNA spesielt oppdaget av et anti-BrdU-antistoff under innfødte forhold. Videre kan DNA-reseksjon også studeres ved hjelp av cellesyklusmarkører for å skille mellom ulike faser av cellesyklusen. Celler i S/G2-fasen tillater studiet av avsluttende reseksjon innen HR, mens G1-celler kan brukes til å studere ikke-homolog endeføyning (NHEJ). En detaljert protokoll for denne IF-metoden kombinert med cellesyklusdiskriminering er beskrevet i dette dokumentet.
Introduction
Modulering av DNA-reparasjonsfaktorer er en stadig utviklende metode for kreftbehandling, spesielt i DNA DSB-reparasjonsdefekterende tumormiljøer. Hemming av spesifikke reparasjonsfaktorer er en av de geniale strategiene som brukes til å sensibilisere kreftceller til DNA-skadelige midler. Tiår med forskning førte til identifisering av ulike mutasjoner av DNA-reparasjonsgener som biomarkører for terapeutiske strategivalg1. Derfor har DNA-reparasjonsfeltet blitt et knutepunkt for narkotikautvikling for å sikre et bredt spekter av behandlinger, og styrke det personlige medisinkonseptet.
DSB-er repareres av to hovedveier: NHEJ og HR2. NHEJ-banen er feilutsatt, og ligaerer raskt de to DNA-endene med lite eller ingen DNA-sluttbehandling og involverer proteinkinase (DNA-PKcs), Ku70/80-komplekset, 53BP1 og RIF1 proteiner3. Hr er derimot en trofast mekanisme initiert av BRCA14. Et viktig skritt i HR-reparasjon er DNA-end reseksjonsprosessen, som er nedbrytningen av de ødelagte endene som fører til enkeltstrenget (ss) DNA med 3′-OH ender. BRCA1 legger til rette for rekruttering av nedstrømsproteiner som danner resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, som er involvert i 5′ til 3′ DNA-reseksjon5.
Den første end-reseksjonen oppnås gjennom endonukleaseaktiviteten til MRE11, noe som muliggjør videre behandling av DNA2- og EXO1-nukleasene. De genererte ssDNA-overhengene er raskt belagt av Replication Protein A (RPA) for å beskytte dem mot videre behandling. Deretter engasjerer BRCA2, PALB2 og BRCA1 seg for å megle forskyvningen av RPA og monteringen av RAD51-kjernen som kreves for homologistyrt reparasjonsmekanisme. En fin balanse mellom bruk av NHEJ og HR er nødvendig for optimalt vedlikehold av genomisk integritet. Banevalget avhenger av cellesyklusfasen. HR brukes fortrinnsvis i S til G2-fasene der DNA-reseksjon er på høyeste nivå, og søsterkromotidene er tilgjengelige for å sikre riktig reparasjon.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) er et av de tidligste proteinene som rekrutteres til DSB. Det regulerer både reseksjonsaktivitet og montering av nedstrømseffektorer involvert i NHEJ5,6. PARP-1 er også nødvendig for DNA enkeltstrenget pausereparasjon under replikering7,8. På grunn av sin viktige rolle i DNA-reparasjon, brukes PARP-hemmere (PARPi) som kreftbehandlinger. I flere HR-mangelfulle kreftformer fører PARPi-behandling til en syntetisk dødelig respons på grunn av manglende evne til HR-mangelfulle celler for å reparere den akkumulerte skaden via en alternativ vei9,10. Det er for tiden fire FDA-godkjente PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib og Talazoparib (også kalt BMN 673), som brukes til ulike bryst- og eggstokkkreftbehandlinger11. PARPi-resistens er imidlertid vanlig, og en potensiell årsak oppstår gjennom reacquisition av HR-ferdigheter12. Tap eller hemming av PARP-1 i nærvær av bestråling dysregulaterer resectosome maskineri, noe som fører til akkumulering av lengre ssDNA-traktater13. Derfor er en grundig studie av DNA-reseksjon in vivo avgjørende for en klarere forståelse av DNA-reparasjonsveiene og den påfølgende utviklingen av nye strategier for å behandle kreft og for å overvinne PARPi-resistens.
Det har vært flere metoder for å oppdage DNA-reseksjonshendelser5. En slik metode er den klassiske IF-baserte teknikken som muliggjør indirekte farging og visualisering av det resekterte DNA etter stressindusert DSB ved hjelp av et anti-RPA-antistoff. Merking av genomisk DNA med 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) og detektering av bare ssDNA er en direkte måling av DNA-reseksjonshendelser. Den omgår overvåkingen av RPA, som er involvert i flere cellulære prosesser som DNA-replikering. I metoden beskrevet her, celler inkubert med BrdU for en enkelt celle syklus tillate BrdU å bli innlemmet i en tråd av replikering cellulære DNA. Etter reseksjon utføres IF-farging under forhold som tillater brdU-deteksjon bare i ssDNA-form, ved bruk av et anti-BrdU-antistoff. Dette antistoffet kan bare få tilgang til eksponerte BrdU-nukleotider og vil ikke oppdage de som er integrert i dobbeltstrenget DNA. Ved hjelp av fluorescensmikroskopi kan det resekterte DNA-et visualiseres i form av punktering brdU / ssDNA foci. Kjerneintensiteten til disse fociene kan brukes som en avlesning for å kvantifisere reseksjon etter DNA-skade. Dette dokumentet beskriver trinnvis prosessene for denne metoden, som kan brukes på de fleste pattedyrcellelinjer. Denne metoden bør være av bred nytte som en enkel måte å overvåke DNA end reseksjon i cellulo, som et konseptbevis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokumentet beskriver en metode som gjør bruk av IF-farging for å måle variasjoner i DNA-reseksjon i cellulo. Den nåværende standarden for å observere en effekt på DNA-reseksjon er gjennom RPA-farging; Dette er imidlertid en indirekte metode som kan påvirkes av DNA-replikasjon. Tidligere har en annen BrdU-inkorporeringsbasert DNA-reseksjon IF-teknikk blitt beskrevet for å klassifisere de resulterende intensitetene i BrdU-positive og BrdU-negative celler. Denne metoden gjorde det mulig for celler so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Marie-Christine Caron for fremragende tekniske råd. Dette arbeidet støttes av midler fra Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. har en Tier 1 Canada Research Chair i DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O’S er en FRQS ph.d.-stipendiat, og S.Y.M er en FRQS postdoktor.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
