Kraalbelasting introduceert eiwitten, plasmiden en deeltjes in aanhankelijke zoogdiercellen. Deze celbelastingstechniek is goedkoop, snel en heeft geen substantiële invloed op de gezondheid van cellen. Het is het meest geschikt voor live-cell imaging.
Veel live-cell imaging-experimenten gebruiken exogene deeltjes (bijv. peptiden, antilichamen, kralen) om cellen te labelen of te functioneren. Het introduceren van eiwitten in een cel over het membraan is echter moeilijk. De beperkte selectie van huidige methoden worstelt met lage efficiëntie, vereist dure en technisch veeleisende apparatuur of functioneert binnen smalle parameters. Hier beschrijven we een relatief eenvoudige en kosteneffectieve techniek voor het laden van DNA, RNA en eiwitten in levende menselijke cellen. Kraalbelasting induceert een tijdelijke mechanische verstoring van het celmembraan, waardoor macromoleculen kunnen binnendringen in aanhankelijke, levende zoogdiercellen. Met minder dan 0,01 USD per experiment is het laden van kralen de goedkoopste methode voor het laden van cellen die beschikbaar is. Bovendien heeft het laden van kralen geen substantiële stress voor cellen of invloed op hun levensvatbaarheid of proliferatie. Dit manuscript beschrijft de stappen van de procedure voor het laden van kralen, aanpassingen, variaties en technische beperkingen. Deze methodologie is vooral geschikt voor beeldvorming van levende cellen, maar biedt een praktische oplossing voor andere toepassingen die de introductie van eiwitten, kralen, RNA of plasmiden in levende, aanhankelijke zoogdiercellen vereisen.
Het laden van macromoleculen in zoogdiercellen vereist een methodologie waarmee ze het plasmamembraan van de cel kunnen passeren1. Verschillende methoden kunnen plasmiden in zoogdiercellen introduceren door transfectie, waaronder liposomale transfectie2 en diethylaminoethyl-dextran transfectie3. Methoden voor het laden van eiwitten of membraandoordringbare deeltjes in cellen zijn echter beperkter.
Verschillende technieken hebben deze moeilijke hindernis omzeild met behulp van verschillende strategieën. Ten eerste levert micro-injectie deeltjes via een micropipette af in levende cellen onder een microscoop4. Hoewel het misschien wel de meest gecontroleerde en minst invasieve methode is, is deze techniek relatief laag omdat cellen één voor één moeten worden geladen. Verder vereist micro-injectie gespecialiseerde apparatuur en is het technisch veeleisend.
Ten tweede is elektroporatie een manier om eiwitten in cellen te injecteren via spanningsgeïnduceerdemembraanverstoring 5,6,7. Deze methode vereist echter opnieuw gespecialiseerde, dure apparatuur en de schok kan celstress en mortaliteit veroorzaken. Verder moeten cellen vóór elektroporatie worden trypsiniseerd en vervolgens opnieuw worden geplateerd, waardoor het tijdsbestek wordt beperkt waarop cellen na elektroporatie kunnen worden onderzocht.
Ten derde kunnen celmembranen chemisch worden gemodificeerd voor tijdelijke, omkeerbare permeabilisatie8,9. Streptolysine-O-belasting brengt een endotoxine in celmembranen in, dat tijdelijke poriën vormt, waardoor exogene membraandoordringbare deeltjes, waaronder eiwitten en DNA-plasmiden, cellen kunnen binnendringen10. Na een herstel van 2 uur herstelt ongeveer de helft van de cellen deze poriën en stopt het internaliseren van deeltjes uit de oplossing. Deze techniek vereist echter een lange hersteltijd en is onverenigbaar met celtypen die endotoxinen niet kunnen verdragen.
Ten vierde laadt mechanische verstoring deeltjes in cellen door fysieke verstoring van het celmembraan11. Dit kan op meerdere manieren worden gedaan, waaronder krabben, schrapen en rollen van kralen bovenop cellen12,13. Al in 1987 werden kralen gebruikt om eiwitten mechanisch in cellen te laden14. Meer recent is de kralenbelastingstechniek geoptimaliseerd en aangepast buiten eiwitten om de belasting van plasmiden en RNA op te nemen, zoals hier beschreven.
Kraal laden is een eenvoudige, goedkope en snelle methode voor het laden van eiwitten en plasmiden in hechtende menselijke cellen. Glasparels worden kort bovenop cellen gerold, waardoor hun celmembraan tijdelijk wordt verstoord. Hierdoor kunnen deeltjes in oplossing binnendringen. Omdat het laden van kralen een laag rendement heeft, is het het meest geschikt voor experimenten met eencellige of eencellige microscopie. Kraalbelasting kan een breed scala aan eiwitten introduceren, waaronder gefragmenteerde antilichamen (Fab),15,16 gezuiverde eiwitten zoals scFvs,17 intrabodies,18,19of mRNA-coatingeiwitten, bijvoorbeeld MS2-coatingeiwit (MCP)20,21. Plasmide-expressievectoren kunnen ook aan de eiwitoplossing worden toegevoegd en tegelijkertijd22, 23,24, 25wordengeladen.
Naast eiwitten en plasmiden zijn moleculen zo groot als 250 nm polystyreenparels in cellen geïntroduceerd via kraalbelasting (persoonlijke communicatie). Het laden van kralen is ongelooflijk goedkoop, kost minder dan 0,01 USD per experiment in materialen en vereist geen extra dure apparatuur. De kosten worden verder verlaagd door het minimaliseren van het aantal sondes dat per experiment wordt gebruikt, omdat alleen de cellen in de centrale microwell met een diameter van 14 mm van een beeldvormingskamer worden geladen. Opgemerkt moet worden dat de beperkte laadruimte betekent dat het laden van kralen niet ideaal is voor het laden van bulkcellen.
Dit manuscript presenteert het proces van het laden van kralen, inclusief hoe het kralenbelastingsapparaat te construeren en een experiment uit te voeren. Het toont aan dat eiwitten, RNA en DNA in verschillende celtypen kunnen worden geladen en dat twee verschillende, tegelijkertijd met kralen geladen eiwitten sterk gecorreleerde cellulaire concentraties en een relatief lage variantie hebben. Ook worden variaties in het protocol besproken op basis van celtype en belasting van eiwit, plasmide of RNA. Hoewel wordt gedacht dat kralen het celmembraan perforeren en verstoren, maakt het kralenbelastingsproces, wanneer het op de juiste manier wordt uitgevoerd, slechts een klein aantal cellen los van de bodem van de beeldvormingskamer. Na een korte herstelperiode blijven cellen groeien en delen. Deze methodologie is ideaal voor live-cell microscopie-experimenten, waaronder single-molecule eiwit- en RNA-tracking, posttranslationele modificatiedetectie, observatie van dynamische cellulaire mechanismen of subcellulaire lokalisatiemonitoring15,16,22,26,27.
De hier beschreven kraalbelastingstechniek is een kosteneffectieve en tijdsefficiënte methode voor het introduceren van macromoleculen en andere deeltjes in aanhankelijke cellen. Dit veelzijdige proces kan eiwitten laden(Figuur 2A)15,16,26,27,een combinatie van eiwitten en plasmiden(Figuur 2B,C)22,25,RNA(Figuur 4C),100 en 250 nm polystyreenparels (persoonlijke correspondentie), synthetische kleurstoffen39 of quantum dots34,40 . Kraalbelasting kan ook de mogelijkheid hebben om andere soorten membraandoordringbare deeltjes te laden. De meest gebruikte toepassing is het laden van antilichamen of Fabs om endogene epitopen, zoals post-translationele modificaties (PTM’s), in levende cellen te richten. Doelwitten, zoals PTM’s, zijn vaak moeilijk te labelen in levende cellen zonder gevestigde PTM-specifieke, genetisch gecodeerde sondes41,42. Daarentegen kan het laden van kralen meerdere soorten sondes, reporters of andere moleculaire hulpmiddelen samen in dezelfde cel introduceren voor het tegelijkertijd bewaken van meerdere uitlelingen. We verwachten dat het laden van kralen een nuttige techniek zal zijn voor het laden van een verscheidenheid aan macromoleculen of deeltjes.
Een groot voordeel van het laden van kralen is de lage kosten: elk experiment kost minder dan 0,01 USD. Een kralenladerapparaat kan gemakkelijk worden gemaakt met behulp van goedkope materialen die in totaal ~ $ 150 kosten, wat aanzienlijk goedkoper is dan elke andere methode voor het laden van cellen. De kosten van een kralenlader kunnen verder worden verlaagd tot minder dan $ 10 door de herbruikbare metalen kamer te vervangen door een plastic kamer. Boor hiervoor een gat in een kamer van 35 mm of verwijder het glas uit een glazen bodemkamer van 35 mm en bevestig het gaas vervolgens stevig op zijn plaats met tape. In plaats van een apparaat kan het laden van kralen zelfs worden uitgevoerd met behulp van een pipetpunt met een brede boring van 1000 μL om kralen op cellen te scheppen en te strooien, hoewel deze variatie het moeilijk maakt om een monolaag van kralen op cellen te strooien (stap 4.6).
Een ander voordeel van het laden van kralen is dat cellen de normale algehele morfologie kunnen behouden, snel kunnen herstellen en blijven groeien en delen, althans voor de hier bestudeerde U2OS-, RPE1- en HeLa-cellen en voor de andere elders bestudeerde cellijnen (Figuur 3; Figuur 4A(B); Aanvullende video 1; en tabel 1)31. Tijdens het laden van kralen ondergaan cellen fysieke stress en verdrijven en schilferen soms (~ 5% van de cellen schilt onder optimale omstandigheden, maar groter celverlies kan optreden als het laden van kralen te krachtig wordt uitgevoerd of als er te veel glasparels bovenop de cellen worden geladen, zoals afgebeeld in figuur 3B). Cellen met kralen die aan de coverslip blijven vastzitten, zien er echter meestal gezond uit en kunnen al 30 minuten na het laden van de kraal worden afgebeeld(figuur 3A). We staan cellen over het algemeen een herstelperiode van 30 minuten toe, maar verwachten dat beeldvorming eerder na het laden van de parel haalbaar is.
Een groot nadeel van deze techniek is dat de cellen bestand moeten zijn tegen kleine fysieke belasting tijdens het laden en zich stevig aan de coverslip moeten blijven hechten. Slecht/niet-hechtende cellijnen of cellen die op gecoate platen zijn gekweekt (bijv. HEK en stamcellen) komen vaak los bij zacht tikken tijdens het laden van kralen. Verder heeft de ervaring geleerd dat primaire neuronen te gevoelig zijn voor het laden van kralen.
Kraalbelasting is het meest geschikt voor experimenten met één cel of één molecuul. In onze ervaring heeft het laden van kralen een efficiëntie van ongeveer 20-40% eiwitbelasting, en ~ 20% van de cellen met kralenbelaste cellen kwam ook tot expressie met een co-loaded plasmide(figuur 2A,B). Kraalladende plasmiden kunnen dus minder efficiënt zijn voor eiwitexpressie dan parellading gezuiverde eiwitten, omdat plasmiden niet alleen cellen moeten binnendringen, maar ook tot expressie moeten worden gebracht (wat onder andere nucleaire import, transcriptie en vertaling inhoudt, die elk de expressie-efficiëntie kunnen verlagen). De lage efficiëntie van met kralen geladen plasmide-expressie kan worden omzeild door alternatieve transfectieprotocollen te gebruiken, zoals lipofectie, voordat kralen eiwitten of sondes laden16,27. Bovendien kan het incuberen van cellen in optimale media gedurende 30 minuten voordat de kraal wordt geladen, de plasmide-expressie bevorderen. Vanwege de lage plasmide-expressie is kraalbelasting niet vaak gebruikt als alternatief voor op lipofectie gebaseerde transfectie in dit laboratorium. De enige uitzondering is wanneer een gezuiverd eiwit, zoals Fab, moet worden samengeladen, in welk geval het heel handig is om het eiwit en plasmide tegelijkertijd te kralen. Bovendien kan voor cellen die niet reageren of intolerant zijn voor lipofectie, het laden van kralen een alternatieve, zij het weinig efficiënte, methode bieden voor voorbijgaande plasmide-expressie.
The authors have nothing to disclose.
We zijn de leden van het Stasevich-lab dankbaar voor talloze gesprekken die hebben bijgedragen aan het verbeteren en ontwikkelen van dit protocol. In het bijzonder Dr. Linda Forero en Dr. Phil Fox voor advies over het laden van kralen in verschillende celtypen. We willen Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato en Dr. Hiroshi Kimura oprecht bedanken voor het delen van hun protocol voor het laden van glazen kralen. We zijn Dr. Ashok Prasad en Dr. Diego Krapf erg dankbaar voor het genereus delen van hun kralenbelastingsprotocollen voor het introduceren van anorganische deeltjes in cellen. We zijn Dr. Travis Sanders, Craig Marshall en Dr. Thomas Santangelo dankbaar voor het genereus delen van hun gelabelde RNA-reagens. ALK, MNS, CAC, GG en TJS werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R35GM119728 en de National Science Foundation (NSF) CAREER grant MCB-1845761, beide aan TJS. CAC werd ook ondersteund door de NSF NRT award DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |