La charge de billes introduit des protéines, des plasmides et des particules dans les cellules adhérentes des mammifères. Cette technique de chargement cellulaire est peu coûteuse, rapide et n’affecte pas considérablement la santé cellulaire. Il est le mieux adapté à l’imagerie de cellules vivantes.
De nombreuses expériences d’imagerie de cellules vivantes utilisent des particules exogènes (p. ex., peptides, anticorps, billes) pour étiqueter ou fonctionner dans les cellules. Cependant, l’introduction de protéines dans une cellule à travers sa membrane est difficile. La sélection limitée de méthodes actuelles est difficile avec une faible efficacité, nécessite des équipements coûteux et techniquement exigeants, ou fonctionne dans des paramètres étroits. Ici, nous décrivons une technique relativement simple et rentable pour charger l’ADN, l’ARN et les protéines dans des cellules humaines vivantes. La charge de billes induit une perturbation mécanique temporaire de la membrane cellulaire, permettant aux macromolécules de pénétrer dans les cellules adhérentes et vivantes des mammifères. À moins de 0,01 USD par expérience, le chargement des billes est la méthode de chargement de cellules la moins coûteuse disponible. De plus, la charge en billes ne stresse pas considérablement les cellules et n’a pas d’impact sur leur viabilité ou leur prolifération. Ce manuscrit décrit les étapes de la procédure de chargement des perles, les adaptations, les variations et les limitations techniques. Cette méthodologie est particulièrement adaptée à l’imagerie des cellules vivantes, mais fournit une solution pratique pour d’autres applications nécessitant l’introduction de protéines, de perles, d’ARN ou de plasmides dans des cellules de mammifères vivantes et adhérentes.
Le chargement de macromolécules dans des cellules de mammifères nécessite une méthodologie qui leur permet de traverser la membrane plasmique de la cellule1. Plusieurs méthodes peuvent introduire des plasmides dans les cellules de mammifères par transfection, y compris la transfection liposomale2 et la transfection diéthylaminoéthyl-dextran3. Cependant, les méthodes de chargement de protéines ou de particules imperméables à la membrane dans les cellules sont plus limitées.
Plusieurs techniques ont contourné cet obstacle difficile en utilisant diverses stratégies. Tout d’abord, la microinjection délivre des particules à travers une micropipette dans des cellules vivantes au microscope4. Bien qu’elle soit sans doute la méthode la plus contrôlée et la moins invasive, cette technique est relativement peu débitée car les cellules doivent être chargées une par une. De plus, la microinjection nécessite un équipement spécialisé et est techniquement exigeante.
Deuxièmement, l’électroporation est un moyen d’électro-injecter des protéines dans les cellules via une perturbation membranaire induite par la tension5,6,7. Cependant, cette méthode nécessite à nouveau un équipement spécialisé et coûteux, et le choc peut causer un stress cellulaire et la mortalité. De plus, les cellules doivent être trypsinisées avant l’électroporation, puis replaquées, ce qui limite le délai auquel les cellules peuvent être étudiées après l’électroporation.
Troisièmement, les membranes cellulaires peuvent être chimiquement modifiées pour une perméabilisation temporaire et réversible8,9. La charge de streptolysine-O insère une endotoxine dans les membranes cellulaires, qui forme des pores temporaires, permettant aux particules exogènes imperméables à la membrane, y compris les protéines et les plasmides d’ADN, d’entrer dans les cellules10. Après une récupération de 2 heures, environ la moitié des cellules réparent ces pores et arrêtent l’internalisation des particules de la solution. Cependant, cette technique nécessite un long temps de récupération et est incompatible avec les types de cellules qui ne peuvent pas tolérer les endotoxines.
Quatrièmement, la perturbation mécanique charge les particules dans les cellules par perturbation physique de la membrane cellulaire11. Cela peut être fait de plusieurs façons, y compris le grattage, le grattage et le roulement des perles au sommet des cellules12,13. Dès 1987, des billes ont été utilisées pour charger mécaniquement des protéines dans les cellules14. Plus récemment, la technique de chargement des billes a été optimisée et adaptée au-delà des protéines pour inclure la charge en plasmides et en ARN, comme décrit ici.
Le chargement de billes est une méthode facile, peu coûteuse et rapide pour charger des protéines et des plasmides dans des cellules humaines adhérentes. Les perles de verre sont brièvement roulées sur les cellules, perturbant temporairement leur membrane cellulaire. Cela permet aux particules en solution d’entrer. Comme la charge de billes a une faible efficacité, elle convient mieux aux expériences de microscopie à molécule unique ou à cellule unique. La charge de billes peut introduire une grande variété de protéines, y compris des anticorps fragmentés (Fab),15,16 protéines purifiées comme les scFvs,17 intracorps,18, 19ou des protéines de couche d’ARNm, par exemple, la protéine de couche MS2 (MCP)20,21. Les vecteurs d’expression plasmidique peuvent également être ajoutés à la solution protéique et chargés simultanémentde billes 22,23,24,25.
Au-delà des protéines et des plasmides, des molécules aussi grosses que des billes de polystyrène de 250 nm ont été introduites dans les cellules via la charge de billes (communication personnelle). Le chargement des perles est incroyablement peu coûteux, coûtant moins de 0,01 USD par expérience dans les matériaux et ne nécessitant aucun équipement coûteux supplémentaire. Le coût est encore réduit en minimisant la quantité de sondes utilisées par expérience, car seules les cellules du micropuit central de 14 mm de diamètre d’une chambre d’imagerie sont chargées. Il convient de noter que la zone de chargement limitée signifie que le chargement des billes n’est pas idéal pour le chargement des cellules en vrac.
Ce manuscrit présente le processus de chargement des perles, y compris la façon de construire l’appareil de chargement des perles et d’effectuer une expérience. Il montre que les protéines, l’ARN et l’ADN peuvent être chargés dans différents types de cellules et que deux protéines différentes, chargées simultanément de billes, ont des concentrations cellulaires fortement corrélées et une variance relativement faible. Les variations du protocole en fonction du type de cellule et de la charge en protéines, plasmides ou ARN sont également discutées. Bien que l’on pense que les perles perforent et perturbent la membrane cellulaire, lorsqu’elles sont effectuées de manière appropriée, le processus de chargement des billes ne déloge qu’un petit nombre de cellules du fond de la chambre d’imagerie. Après une courte période de récupération, les cellules continuent de croître et de se diviser. Cette méthodologie est idéale pour les expériences de microscopie de cellules vivantes, y compris le suivi des protéines et de l’ARN à molécule unique, la détection de modifications post-traductionnelles, l’observation de mécanismes cellulaires dynamiques ou la surveillance de la localisation subcellulaire15,16,22,26,27.
La technique de chargement des billes décrite ici est une méthode rentable et rapide pour introduire des macromolécules et d’autres particules dans les cellules adhérentes. Ce procédé polyvalent peut charger des protéines (Figure 2A)15,16,26,27, une combinaison de protéines et de plasmides ( Figure2B,C)22,25, ARN ( Figure4C), 100 et 250 nm perles de polystyrène (correspondance personnelle), colorants synthétiques39 ou points quantiques34,40 . La charge de billes peut également avoir la capacité de charger d’autres types de particules imperméables à la membrane. Son application la plus fréquemment utilisée est le chargement d’anticorps ou de Fabs pour cibler les épitopes endogènes, tels que les modifications post-traductionnelles (PTM), dans les cellules vivantes. Les cibles, telles que les PTM, sont souvent difficiles à étiqueter dans les cellules vivantes sans sondes établies spécifiques au PTM, génétiquement codées41,42. En revanche, le chargement de billes peut introduire plusieurs types de sondes, de rapporteurs ou d’autres outils moléculaires ensemble dans la même cellule pour surveiller plusieurs lectures simultanément. Nous prévoyons que le chargement de billes sera une technique utile pour charger une variété de macromolécules ou de particules.
Un avantage majeur du chargement de perles est le faible coût: chaque expérience coûte moins de 0,01 USD. Un appareil de chargement de billes peut être fabriqué facilement en utilisant des matériaux peu coûteux coûtant au total ~ 150 $, ce qui est nettement moins cher que toute autre méthode de chargement de cellules. Le coût d’un appareil de chargement de billes peut être réduit à moins de 10 $ en remplaçant la chambre métallique réutilisable par une chambre en plastique. Pour cela, percez un trou dans une chambre de 35 mm ou retirez le verre d’une chambre à fond de verre de 35 mm, puis fixez solidement le maillage en place avec du ruban adhésif. Au lieu d’un appareil, le chargement des billes peut même être effectué à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL à large alésage pour prévenir et saupoudrer des billes sur les cellules, bien que cette variation rende difficile l’aspersion d’une monocouche de billes sur les cellules (étape 4.6).
Un autre avantage de la charge en billes est que les cellules peuvent conserver une morphologie globale normale, se rétablir rapidement et continuer à croître et à se diviser, au moins pour les cellules U2OS, RPE1 et HeLa étudiées ici et pour les autres lignées cellulaires étudiées ailleurs (Figure 3; Figure 4A,B; Vidéo supplémentaire 1; et Tableau 1)31. Pendant le chargement des billes, les cellules subissent un stress physique et parfois se délogent et se pelent (~ 5% des cellules pelent dans des conditions optimales, mais une perte cellulaire plus importante peut se produire si la charge des billes est effectuée avec trop de force ou si trop de perles de verre sont chargées sur les cellules, comme illustré à la figure 3B). Cependant, les cellules chargées de billes qui restent attachées au couvercle semblent généralement saines et peuvent être imagées dès 30 minutes après le chargement des billes(Figure 3A). Nous accordons généralement aux cellules une période de récupération de 30 minutes, mais nous prévoyons que l’imagerie plus tôt après le chargement des billes est possible.
Un inconvénient majeur de cette technique est que les cellules doivent être capables de résister à un stress physique mineur pendant le chargement et rester solidement adhérentes au couvercle. Les lignées cellulaires ou les cellules mal ou non adhérentes cultivées sur des plaques revêtues (p. ex., HEK et cellules souches) se détachent souvent en tapotant doucement pendant le chargement des billes. De plus, l’expérience a montré que les neurones primaires sont trop sensibles pour la charge des billes.
La charge de billes est la mieux adaptée aux expériences à cellule unique ou à molécule unique. D’après notre expérience, la charge en billes a une efficacité de charge en protéines d’environ 20 à 40%, et ~ 20% des cellules chargées en perles ont également exprimé un plasmide co-chargé(Figure 2A,B). Ainsi, les plasmides à charge de billes peuvent être moins efficaces pour l’expression des protéines que les protéines purifiées à charge de billes, car les plasmides doivent non seulement pénétrer dans les cellules, mais aussi être exprimés (ce qui implique, entre autres, l’importation nucléaire, la transcription et la traduction, dont chacun peut réduire l’efficacité d’expression). La faible efficacité de l’expression plasmidique chargée de billes peut être contournée en utilisant des protocoles de transfection alternatifs, tels que la lipofection, avant les protéines de charge de billes ou les sondes16,27. De plus, l’incubation de cellules dans un milieu optimal pendant 30 minutes avant le chargement des billes peut aider à l’expression des plasmides. En raison de la faible expression plasmidique, la charge en billes n’a pas souvent été utilisée comme alternative à la transfection à base de lipofection dans ce laboratoire. La seule exception est lorsqu’une protéine purifiée, telle que Fab, doit être co-chargée, auquel cas il est très pratique de charger la protéine et le plasmide en même temps. De plus, pour les cellules qui ne répondent pas ou qui sont intolérantes à la lipofection, la charge en billes peut fournir une autre méthode, bien que peu efficace, pour l’expression transitoire des plasmides.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants aux membres du laboratoire Stasevich pour les innombrables conversations qui ont contribué à améliorer et à développer ce protocole. Plus précisément, la Dre Linda Forero et le Dr Phil Fox pour obtenir des conseils sur le chargement de perles de différents types de cellules. Nous tenons à remercier sincèrement la Dre Yoko Hayashi-Takanaka, la Dre Yuko Sato et le Dr Hiroshi Kimura d’avoir partagé leur protocole de chargement des billes de verre. Nous sommes très reconnaissants au Dr Ashok Prasad et au Dr Diego Krapf d’avoir généreusement partagé leurs protocoles de chargement de billes pour introduire des particules inorganiques dans les cellules. Nous sommes reconnaissants au Dr Travis Sanders, Craig Marshall et au Dr Thomas Santangelo d’avoir généreusement partagé leur réactif d’ARN étiqueté. ALK, MNS, CAC, GG et TJS ont été soutenus par la subvention R35GM119728 des National Institutes of Health (NIH) et la subvention CAREER MCB-1845761 de la National Science Foundation (NSF), toutes deux à TJS. CAC a également été soutenu par le prix NSF NRT DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |