JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Pärla laddar proteiner och nukleinsyror i vidhäftande mänskliga celler

Published: June 01, 2021
doi:
10.3791/62559
, , , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,Colorado State University, 2World Research Hub Initiative, Institute of Innovative Research,Tokyo Institute of Technology

Summary

Pärlbelastning introducerar proteiner, plasmider och partiklar i vidhäftande däggdjursceller. Denna cellladdningsteknik är billig, snabb och påverkar inte cellhälsan väsentligt. Den är bäst lämpad för live-cell imaging.

Abstract

Många levande celltomografiexperiment använder exogena partiklar (t.ex. peptider, antikroppar, pärlor) för att märka eller fungera i celler. Det är dock svårt att införa proteiner i en cell över membranet. Det begränsade urvalet av nuvarande metoder kämpar med låg effektivitet, kräver dyr och tekniskt krävande utrustning eller funktioner inom smala parametrar. Här beskriver vi en relativt enkel och kostnadseffektiv teknik för att ladda DNA, RNA och proteiner i levande mänskliga celler. Lastning av pärlor inducerar en tillfällig mekanisk störning i cellmembranet, vilket gör det möjligt för makromolekyler att komma in i vidhäftande, levande däggdjursceller. Vid mindre än 0,01 USD per experiment är pärlbelastning den billigaste cellinläsningsmetoden som finns tillgänglig. Dessutom stressar lastning av pärl inte i någon större utsträckning celler eller påverkar deras livskraft eller spridning. Detta manuskript beskriver stegen i pärlbelastningsproceduren, anpassningar, variationer och tekniska begränsningar. Denna metod är särskilt lämpad för levande cellavbildning men ger en praktisk lösning för andra applikationer som kräver införande av proteiner, pärlor, RNA eller plasmider i levande, vidhäftande däggdjursceller.

Introduction

Att ladda makromolekyler i däggdjursceller kräver metodik som gör det möjligt för dem att korsa cellens plasmamembran1. Flera metoder kan införa plasmider i däggdjursceller genom transfektion, inklusive liposomal transfekt2 och diethylaminoetyl-dextran transfection3. Metoderna för att ladda proteiner eller membrangenomträngliga partiklar i celler är dock mer begränsade.

Flera tekniker har kringgått detta svåra hinder med hjälp av olika strategier. För det första levererar mikroinjektion partiklar genom en mikroskopering till levande celler under ett mikroskop4. Även om förmodligen den mest kontrollerade och minst invasiva metoden, är denna teknik relativt låg genomströmning eftersom celler måste laddas en efter en. Vidare kräver mikroinjektion specialiserad utrustning och är tekniskt krävande.

För det andra är elektroporering ett sätt att elektroinjekt proteiner i celler via spänningsinducerademembranstörningar 5,6,7. Denna metod kräver dock återigen specialiserad, dyr utrustning, och chocken kan orsaka cellstress och dödlighet. Vidare måste cellerna trypsiniseras före elektroporering och därefter replateras, vilket begränsar tidsramen för cellerna att undersökas efter elektroporering.

För det tredje kan cellmembran modifieras kemiskt för tillfällig, reversibel permeabilisering8,9. Streptolysin-O-lastning sätter in ett endotoxin i cellmembran, som bildar tillfälliga porer, vilket gör det möjligt för exogena membrangenomträngliga partiklar, inklusive proteiner och DNA-plasmider, att komma in icellerna 10. Efter en 2 h återhämtning reparerar ungefär hälften av cellerna dessa porer och stoppar internalisering av partiklar från lösningen. Denna teknik kräver dock en lång återhämtningstid och är inkompatibel med celltyper som inte kan tolerera endotoxiner.

För det fjärde lastar mekaniska störningar partiklar i celler genom fysisk störning av cellmembranet11. Detta kan göras på flera sätt, inklusive repor, skrapning och rullande pärlor ovanpåcellerna 12,13. Redan 1987 har pärlor använts för att ladda proteiner i celler mekaniskt14. På senare tid har pärlbelastningstekniken optimerats och anpassats bortom proteiner för att inkludera lastning av plasmider och RNA, som beskrivs här.

Pärlbelastning är en enkel, billig och snabb metod för att ladda protein och plasmider i vidhäftande mänskliga celler. Glaspärlor rullas kort ovanpå celler, vilket tillfälligt stör deras cellmembran. Detta gör att partiklar i lösningen kan komma in. Eftersom pärlbelastning har låg effektivitet är den bäst lämpad för enmolekyls- eller encelliga mikroskopiexperiment. Pärlbelastning kan introducera ett brett spektrum av proteiner, inklusive fragmenterade antikroppar (Fab),15,16 renade proteiner som scFvs,17 intrakroppar,18,19eller mRNA-pälsproteiner, t.ex. MS2-pälsprotein (MCP)20,21. Plasmid uttryck vektorer kan också läggas till proteinlösningen och pärla-laddade samtidigt22,23,24,25.

Utöver proteiner och plasmider har molekyler så stora som 250 nm polystyrenpärlor introducerats i celler via pärlbelastning (personlig kommunikation). Pärlbelastning är otroligt billigt, kostar mindre än 0.01 USD per experiment i material och kräver ingen extra dyr utrustning. Kostnaden minskas ytterligare genom att minimera mängden sonder som används per experiment eftersom endast cellerna i en bildkammares centrala mikrobrunn med diametern 14 mm är laddade. Det bör noteras att det begränsade lastområdet innebär att lastning av pärlor inte är idealisk för bulkcellsbelastning.

Detta manuskript presenterar pärlladdningsprocessen, inklusive hur man konstruerar pärlbelastningsapparaten och utför ett experiment. Det visar att proteiner, RNA och DNA kan laddas in i olika celltyper och att två olika, samtidigt pärlbelastade proteiner har mycket korrelerade cellulära koncentrationer och relativt låg varians. Också diskuteras är variationer i protokollet baserat på celltyp och lastning av protein, plasmid eller RNA. Även om pärlor tros perforera och störa cellmembranet, när de utförs på lämpligt sätt, lossar pärlbelastningsprocessen endast ett litet antal celler från botten av bildkammaren. Efter en kort återhämtningsperiod fortsätter cellerna att växa och dela sig. Denna metodik är idealisk för levande cellmikroskopi experiment, inklusive enmolekyl protein och RNA spårning, post-translationell modifiering upptäckt, observation av dynamiska cellulära mekanismer eller subcellulär lokalisering övervakning15,16,22,26,27.

Protocol

1. Rengör, sterilisera och torka glaspärlor för att undvika klumpar och säkerställa jämn spridning ovanpå cellerna. Sterilisera cirka 5 ml glaspärlor i natriumhydroxid (NaOH). Mät pärlorna i ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 25 ml 2 M NaOH och blanda försiktigt med en skakapparat eller rotator i 2 timmar. Dekantera NaOH och behåll så många pärlor som möjligt. Om pärlorna är i suspension, snurra ner röret av pärlor kort i en centrifug (1 min vid ~ 1000 × g, rumstemperatur). Tvätta pärlorna noggrant med cellkulturklassat vatten tills pH-talet är neutralt (använd en pH-testremsa på eluenten för att bekräfta ett neutralt pH). Dekanta tvättvattnet varje gång, som tidigare. Tvätta pärlorna noggrant med 100% etanol 2-3x. Dekanta etanol varje gång, som tidigare. Torka pärlorna. Strö pärlorna för att bilda ett tunt lager inuti en steril behållare (till exempel en 10 cm Petri-skål). Lämna behållaren öppen, låt pärlorna lufttorka i ett biosäkerhetsskåp över natten. Se till att pärlorna är helt torra genom att knacka eller försiktigt skaka behållaren och kontrollera att pärlorna har en sandig konsistens utan klumpar eller flagning. UV-sterilisera de torra pärlorna i 15 minuter. 2. Montera pärlorna. Fäst en nätplätt (polypropylen eller motsvarande material, 105 μm öppningar så att pärlorna kan passera igenom) för att täcka hela öppningen av pärlor som håller kammaren med antingen tejp eller spänner fast nätet mellan han- och honändarna på en metallåteranvändbar bildkammare (Figur 1A). UV-sterilisera apparaten i 15 minuter. Tillsätt pärlorna i apparaten och försegla den tätt med vaxartad film.OBS: Det är viktigt att pärlorna är helt rena och torra i detta steg. De ska vara lösa och se sandiga ut utan klumpar. Om de inte visas så, tvätta om och torka pärlorna helt. Förvara apparaten i en förseglad, torr behållare uttorkad med kiselgel eller annat torkmedel. Om pärlor blir fuktiga, vilket kommer att vara uppenbart genom pärlklumpning, torka noggrant och sterilisera pärllastaren och ersätt med färska pärlor.OBS: Alla dessa försiktighetsåtgärder förhindrar att mögel eller bakterier växer på eller runt pärlorna i pärllastaren. Pärlorlastarapparaten kan tillverkas på olika sätt. Se detaljerna i diskussionen. 3. Förbered glasbottenkammare av vidhäftande celler. Frö vidhäftande däggdjursceller på en 35 mm glasbottenkammare. Se till att cellerna är cirka 80% konfluenta vid tidpunkten för pärlbelastning. (Se tabell 1 för mer information om olika celltyper och anteckningar om hur effektiv pärlor som läses in i olika celltyper.)OBS: Celler kan endast sås i mikrohuset i mitten av kammaren för att spara hur många celler som används. Inkubera cellerna under normala förhållanden tills de är helt vidhäftande mot glaset.OBS: Det är viktigt att celltätheten är tillräckligt hög och att cellerna sitter fast ordentligt på glaset. Om dessa krav inte uppfylls kommer cellerna sannolikt att skalas av under lastning av pärlor. Tidslinjen mellan cellfröning och pärlbelastning kan förlängas för att säkerställa korrekt cell vidhäftning och samtidighet. 4. Lastceller för pärlor OBS: Tvätta cellerna kort med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt sedan 2 ml av det optimala mediet. Inkubera i minst 30 minuter. Gör en lösning på 3-8 μL som innehåller önskade plasmider, protein och/eller partiklar. Använd ~1 μg (0,1-1 pmol) av varje typ av plasmid och ~0,5 μg (0,01 nmol) protein, beroende på experimentella krav. Använd ett lågretentionsrör för proteiner så att de inte lämnas kvar på rörväggarna. För upp lösningen till minst 3 μL med PBS och justera lösningsvolymen så att hela cellområdet belagdas (dvs. kammarens mikrobrunn, figur 1B). Blanda lösningen noggrant genom att leda upp och ner och/eller snärta röret. Snurra kort lösningen ner till botten av röret i en bordsmikrofuge. Överför pärlbelastningslösningen och cellkammaren till en vävnadskulturhuva. Utför de återstående stegen i vävnadskulturhuven med steril teknik. Ta bort mediet från cellerna och förvara det tillfälligt i ett sterilt rör. Aspirera försiktigt alla medier runt kammarens kanter och luta kammaren i ungefär 45° vinkel och ta bort den återstående droppen av media i mittmikrobrunnen. Under medium borttagning, se till att undvika att låta pipettspetsen röra glaset, vilket kan leda till cellskalning och förlust. Flytta snabbt till nästa steg så att cellerna inte är torra länge. Pipetten försiktigt pärlbelastningslösningen på glasmikrobrunnen i mitten av kammaren. Tillval: Inkubera med skonsam gungning i ~30 s utan att kammaren kan torka upp helt. Sprid försiktigt ut ett monoskikt av glaspärlor ovanpå cellerna, helst med hjälp av en lastapparat för pärlor (figur 1A). Se till att pärlorna täcker cellerna i mikrohuset med glasbotten helt. Nyp ihop kammaren med två fingrar, knacka den mot huvens yta genom att lyfta den ~ 2 tum och ta ner den ordentligt. Använd en kraft som är ungefär lika stor som att släppa skålen från den höjden. Upprepa för totalt ~10 tryck.OBS: Se till att kranarna inte skalar cellerna i någon större utsträckning. Tryckning kan optimeras för celltypen. Om cellerna laddas dåligt trycker du hårdare. men om många celler skalar av, knacka lättare. Lägg försiktigt tillbaka medium i kammaren genom att långsamt leda till att kammarens plastsida rörs. Försök att aspirera eventuella flytande pärlor utan att störa cellerna. Lägg till fler förvärmda media i det här steget om för mycket har tagits bort. Inkubera cellerna i 0,5-2 h i inkubatorn. UV-sterilisera pärllastaren i 15 minuter innan den återförs till förvaring under uttorkande förhållanden. Tillsätt färgämne (t.ex. DAPI- eller HaloTag ligand-fläck, om experimentet kräver det) i cellerna enligt tillverkarens rekommenderade protokoll. Tvätta cellerna 3x med medium före avbildning för att ta bort pärlor och överflödiga laddningskomponenter i lösningen. Undvik pipetting direkt på celler för att hindra dem från att skala. 5. Avbilda de pärlbelastade cellerna Avbilda cellerna omedelbart eller när experimentet krävs. Använd ett mikroskop som kan fånga fluorescens (lasrar eller monokromatisk ljuskälla). Se till att excitationsvåglängderna är lämpliga för den valda fluorforen eller färgämnet (t.ex. 488 nm våglängdsljus för grönt fluorescensprotein (GFP)).OBS: Pärlbelastad protein kan avbildas när cellerna har återhämtat sig (så snart som 30 min efterladdning för de cellinjer som beskrivs här). Plasmiduttryck ≥2 h beroende på uttrycksvektorelement (figur 1C, och ytterligare förklaring i diskussionen). Avbildning av bead-laddade celler kan utföras på alla mikroskop utrustade med lämpliga fluorescerande källor i samband med laddade sonder, en kamera som kan fånga fluorescensbilder, såsom en elektron-multiplicerande laddningsankparad enhet (EMCCD) eller vetenskaplig kompletterande metalloxidhalvledare (sCMOS) kamera och en inkubator för att kontrollera temperatur, fuktighet och koldioxid. För en guide till fluorescensmikroskopi, se 27.

Representative Results

Den vanligaste tillämpningen av pärlbelastning är att introducera en eller flera typer av protein i vidhäftande mänskliga celler. För att illustrera detta var cellerna pärlbelastade med en lösning av ett Cy3- och Alexa488-konjugerat Fab-protein. Även om inte alla celler i mikrobrunnen var pärllastade, hade cellerna som laddades nästan alltid både Cy3- och Alexa488-märkta proteiner tillsammans (Figur 2A). Enligt en tidigare uppskattning, när 0,5 mikrogram Fab utspädd i 4 mikroliter är pärlbelastad29, som i figur 2A, laddas varje cell med ungefär 106 Fab-molekyler. Plasmid DNA-kodning GFP (1 μg plasmid-DNA, 1,8 μL av en 557 ng/μL-lösning) och 0,5 μg Cy3-märkt Fab introducerades också i celler via pärlbelastning och uttrycktes och visualiserades därefter (figur 2B). GFP fluorescensen indikerade att GFP-kodning plasmid inte bara laddades i celler utan också uttryckt. Således kan pärlbelastning i samma cell införa en proteinsond (t.ex. Cy3-märkt Fab) och reporterplasmid (t.ex. GFP), som utförts i detta laboratorium tidigare22,23,24. Vi fastslog att 40% av cellerna var pärlbelastade med Fab-protein och 21% av de pärlbelastade cellerna uttryckte den medlastade plasmiden, vilket visas i de representativa synfälten i figur 2B. Vanligtvis är varje kammare laddad med 1-2 μg plasmid, ungefär samma mängd som lipofection. Pärlbelastade celler uttrycker mycket varierande nivåer av plasmider (Figur 2C,D). För att specifikt mäta detta använde vi Fisher Ratio-testet för att jämföra fördelningen av protein- och plasmidintensitetsdata. Resultaten visade att även om proteinerna 1 och 2 hade liknande intensitetsfördelningar (p = ~ 1), hade varje protein en betydligt mindre fördelning än plasmiden (p = 3,2e-6 och 1,8e-5). Även om detta kan bero på variation i hur många plasmider som laddas per cell, kan den större källan till variabilitet uppstå från de många steg som krävs för plasmiduttryck som sannolikt kommer att variera kraftigt mellan celler, inklusive att importeras till cellkärnan, transkription och översättning. Däremot hade nivåerna av pärllastade proteiner liten cell-till-cell-varians, och nivåerna av två samtidigt laddade proteiner var mycket korrelerade med varandra (figur 2D,E). Plasmid uttryck kan ses så tidigt som 2-4 h post pärla belastning men kan uppstå senare beroende på när optimala plasmid uttryck erhålls. Vi rekommenderar att du utför en tidskurs för att bestämma det bästa uttrycksfönstret för en specifik plasmid som sträcker sig över 2-24 h efter pärlbelastning. Detta kan göras i en kammare med lång tidsramsavbildning eller genom pärlbelastning och häpnadsväckande flera kamrar. Pärlbelastade celler förblir vidhäftande och är tillräckligt friska för att växa och dela sig. Pärl-laddade mänskliga U2OS celler avbildades direkt före, direkt efter och 24 h efter pärla lastning. Korrekt pärlbelastning hade nästan ingen märkbar effekt på antalet celler eller deras morfologi, vilket visas i figur 3A (vänster, mitten). Däremot avbildas dålig pärlbelastning med för många pärlor och överdriven gängkraft i figur 3B. Detta orsakade mycket cellförlust (stora fläckar av täckglaset utan celler och fristående, flytande, out-of-focus celler), dålig cellmorfologi (celler som verkar avrundade och dåligt vidhäftade) och kluster av pärlor kvar på täckglaset efter pärlbelastning. Även om celler tros genomgå mekanisk skada under pärlbelastning, växte celler och förökade sig i den korrekt pärlbelastade kammaren, vilket framgår av det ökade antalet celler 24 h efter pärlbelastning (Figur 3A, höger). Effekten på cellens livskraft kan bedömas genom en mängd olika analyser, såsom en 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analys, för att jämföra pärla-laddade med mock-laddade celler30. Dessutom visar detta och tidigare arbete att de pärlbelastade cellerna genomgår celldelning (figur 3C och kompletterande video 1), och tidpunkten för mitos påverkas inte av pärlbelastning31, vilket tjänar som ytterligare bevis för ihållande cellhälsa efter pärlbelastning. Pärlbelastning är en mångsidig teknik som rymmer flera vidhäftande cellinjer och olika makromolekyler. Här har denna sort demonstrerats genom att ladda RPE1 och HeLa cellinjer med Fab (Figur 4A, B). Tabell 1 ger ytterligare exempel på pärlbelastning i olika cellinjer, i detta laboratorium och därefter, och pekar på några av de nyanserade skillnaderna mellan pärlbelastningsprotokoll från andra labb. Observera att diametern på glaspärlor som används för lastning varierar kraftigt mellan laboratorier, även om den mest effektiva belastningen hittades för små 75 μm diameterpärlor i flera cellinjer14. Dessutom har detta laboratorium börjat lasta RNA också (data visas inte). Figur 4C visar en representativ U2OS-cellpärla laddad med en Cy5-RNA 9mer och Cy3-DNA 28mer tillsammans. Bild 1:Apparat för lastning av pärlor, teknik och tidslinje Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 2. Pärlbelastning medför låg variabilitet i proteinkoncentrationen men hög variation i plasmiduttryck. (A) Cellerna var pärlbelastade med 0,5 μg av var och en av Alexa488-konjugerade anti-H3K27 acetyl Fab (grön) och Cy3-konjugerad anti-RNAPII-Serine 5-fosforylerad Fab (röd) i 4 μL pärlbelastningslösning. Cellerna var DAPI-färgade (blå) och sedan live-imaged omedelbart. Skalstänger = 20 μm. (B) Cellerna var pärllastade med 0,5 μg Fab-protein (Cy3-konjugerad anti-RNAPII-Serin 5-fosforylerat protein, rött) och 1 μg plasmidkodning superfolder GFP-H2B (grön) i 4 μL pärlbelastningslösning. Efter 24 h var cellerna DAPI-färgade (blå) och avbildas live. Skalstänger = 30 μm. (C-E) Protein 1 (JF646-HaloLigand-märkt HaloTag-MCP), protein 2 (Cy3-konjugerad anti-FLAG Fab) och en plasmidkodning EGFP (λN-EGFP-LacZ) lastades ihop i celler. Den totala intensiteten i varje fluorescerande kanal mättes i ett 1,3 x 1,3 μm plåster i cytoplasman i varje cell. N = 25 celler. C)Representativa celler som uttrycker den pärlbelastade plasmiden λN-EGFP-LacZ. Samma bildframställning villkor och intensiteter användes för alla celler. Fläckar är aggregat av det uttryckta proteinet. Skalstänger = 10 μm. (D) Diagrammet visar varje cells totala intensitet av antingen protein 1, protein 2 eller EGFP uttryckt från plasmiden. Varje kanal normaliserades till medianvärdet. Bonferroni-korrigerade P-värden beräknades genom Fisher Ratio-testet för att avgöra om fördelningen av protein- eller plasmidintensitetsdata har samma variabilitet. Varje punkt representerar en cell. e)De totala intensiteterna för antingen båda proteinerna, protein 1 och plasmiden, eller protein 2 och plasmiden, plottas mot varandra. Beräknade R2-värden visas. Varje punkt representerar en cell. Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; A.U. = godtyckliga enheter; MCP = MS2 pälsprotein; RNAPII = RNA-polymeras II. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Figur 3:Pärlbelastade celler förblir vidhäftande och är tillräckligt friska för att växa och dela. (A) U2OS-celler var pärlbelastade med 0,5 μg Cy3-konjugerad anti-FLAG Fab i 4 μL pärlbelastningslösning. Cellerna avbildades direkt före, direkt efter pärlbelastning, och 24 timmar efter pärlbelastning. Orange pilar identifierar områden där celler skalades av under pärlbelastning. Skalstänger = 2 mm. (B) Representativ bild av U2OS-celler pärlbelastade med komponenter från (A) men med hård gängning och för många pärlor. Den röda pilen identifierar extra glaspärlor. Skalstång = 2 mm. (C) U2OS-celler laddades med 1,5 μg av de 14,4 kbp plasmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugerad anti-FLAG Fab (grön), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) i 8 μL pärla lastlösning. Direkt före avbildningen var HaloTag fläckad med JF646-HaloLigand. MS2 stam-loopar av mRNA transkriberas från reporterplasmid är märkta av MCP (magenta fläckar) och FLAG-märkt översatt reporter protein är märkt av anti-FLAG Fab (grön colocalization till mRNA). Moget Fab-märkt protein lokaliserar till kärnan. Denna cell var avbildad 4-15 h efter pärla lastning. Gula pilar identifierar cellkärnan före och atomkärnor efter celldelning. Skalstänger = 5 μm. Förkortning: MCP = MS2 coat protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Figur 4:Variationer i lastmaterial av celltyp i lastprotokollet för pärl. A-B) RPE1 (A) och HeLa (B) celler var pärla-laddade med 1,5 μg av en nukleär Fab protein (anti-RNAPII-Serine 5-fosforylering) i 4 μL lastlösning. Varje cells kärna (nuc) och cytoplasma (cyto) är markerade. Celler avbildades 6 h efter att ha laddats med pärla. Skala stänger = 5 μm. (C) Mänskliga U2OS celler var pärla-laddade med både Cy5-RNA 9mer (magenta) och Cy3-DNA 28mer (grön) oligos, 10 picomoles av varje, i 4 μL av pärla lastning lösning. Celler avbildades 4 h efter att ha laddats med pärla. Alla cellkärnor markeras med en streckad linje. Skalstänger = 5 μm. Förkortningar: RNAPII = RNA-polymeras II. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Cellinje Celltyp Lasteffektivitet för pärlbelastning Anteckningar/referens Stamceller (mänskliga) Embryonala stamceller Svår *Många celler skalar av under pärlbelastning om de pläteras på gelatinbelagda plattor HEK 293 Mänskliga embryonala njurceller Svår *Måste lägga ner en gelmatris till bildkammarens yta innan pärlan laddas. Knacka försiktigt när pärlan laddas först. Nervceller (råtta) Primära embryonala nervceller (e-18), dissocierade Mycket ineffektivt *Effektiv pärla lastning av nervceller observerades inte med hjälp av denna standard pärla belastning protokoll. Detta kan bero på neuroners icke-vidhäftande natur eller på följdskador på neurala processer. MDCK (hund) Madin-Darby hund njurceller Se McNeil och Warder (1987)14 *Lågeffektiv pärlalastning 14 U2OS (människa) Osteosarkom Standardprotokoll för lastning av pärlor HeLa (människa) Livmoderhalscancer Standardprotokoll för lastning av pärlor RPE1 (människa) Epitelceller odödliga med hTERT Standardprotokoll för lastning av pärlor HFF (människa) Primära förhudsfibroblaster Se Besteiro et al. (2009)31  *Ändrat protokoll för lutning istället för att trycka på31 BALB/c 3T3, NIH 3T3 och Schweiziska 3T3 (mus) Embryonala fibroblaster Se Gilmore och Romer (1996)32, Emerson et al. (2014)33 och McNeil och Warder (1987)14 *425–600 μm glaspärlor rapporterade32 *Används 200–300 μm glaspärlor33 *75 μm glaspärlor gav bättre resultat än 400 μm14 DM (indisk muntjac) Hudfibroblaster Se Manders, Kimura och Cook (1999)34 CHO (hamster) Epitelliknande äggstocksceller Se Memedula och Belmont (2003)35 *Används 425–600 μm glaspärlor35 BAE (nötkreatur) Endotelceller av nötkreatur (BAEC-11) Se McNeil och Warder (1987)14 *75 μm glaspärlor gav bättre resultat än 400 μm14 PtK-2 (Potomus tridaclylis) Epitel njurceller Se McNeil och Warder (1987)14 *75 μm glaspärlor gav bättre resultat än 400 μm14 HUVEC (människa) Navelsträngsceller Se Gilmore och Romer (1996)32 *Används 425–600 μm glaspärlor32 J774 och J774.2 (mus) monocyt makrofagceller Se Becker et al. (2005)36 och McNeil och Warder (1987)14 *Skonsam agitation (istället för gängning) och 425–600 μm glaspärlor36 MS-5 (mus) benmärgs stromal celler Se Molenaar et al. (2003)37 WPE1-NB11 (människa) prostata epitelceller Se Gilmore och Romer (1996)32 och *Används 425–600 μm glaspärlor32 Emerson et al. (2014)33 *Används 200–300 μm glaspärlor33 Tabell 1: Pärlor som laddas i olika cellinjer. För de cellinjer som ännu inte har lästs in i detta laboratorium tillhandahålls referenser och anteckningar om variationer i protokollet. Kompletterande video 1: Exempel på en pärlinläst cell som genomgår celldelning. U2OS-celler laddades med 1,5 μg av 14,4 kbp plasmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugerad anti-FLAG Fab (grön), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) i 8 μL pärllastlösning. Direkt före avbildningen var HaloTag fläckad med JF646-HaloLigand. MS2 stam-loopar av mRNA transkriberas från reporterplasmid är märkta av MCP (magenta fläckar) och FLAG-märkt översatt reporter protein är märkt via anti-FLAG Fab (grön colocalization till mRNA). Moget Fab-märkt protein lokaliserar till kärnan. Denna cell var avbildad 4-15 h efter pärla lastning. Skalstång = 10 μm. Förkortning: MCP = MS2 coat protein. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Discussion

Den pärlbelastningsteknik som beskrivs här är en kostnadseffektiv och tidseffektiv metod för att introducera makromolekyler och andra partiklar i vidhäftande celler. Denna mångsidiga process kan ladda protein(figur 2A)15,16,26,27,en kombination av protein och plasmider(figur 2B,C)22,25,RNA ( Figur4C), 100 och 250 nm polystyrenpärlor (personlig korrespondens), syntetiska färgämnen39 eller kvantprickar34,40 . Pärlbelastning kan också ha förmågan att ladda andra typer av membrangenomträngliga partiklar. Dess mest använda applikation är för att ladda antikroppar eller Fabs för att rikta endogena epitoper, såsom post-translationella modifieringar (PTMs), i levande celler. Mål, såsom PTMs, är ofta svåra att märka i levande celler utan etablerade PTM-specifika, genetiskt kodadesonder 41,42. Däremot kan pärlbelastning introducera flera typer av sonder, reportrar eller andra molekylära verktyg tillsammans i samma cell för övervakning av flera avläsningar samtidigt. Vi förväntar oss att pärlbelastning kommer att vara en användbar teknik för att ladda en mängd makromolekyler eller partiklar.

En stor fördel med pärlbelastning är den låga kostnaden: varje experiment kostar mindre än 0,01 USD. En pärllastarapparat kan enkelt göras med billiga material som kostar totalt ~ $ 150, vilket är betydligt billigare än någon annan cellbelastningsmetod. Kostnaden för en pärllastarapparat kan minskas ytterligare till under $ 10 genom att ersätta den återanvändbara metallkammaren med en plast. För detta, antingen borra ett hål i en 35 mm kammare eller ta bort glaset från en 35 mm glasbottenkammare och fäst sedan nätet ordentligt på plats med tejp. I stället för en apparat kan pärlbelastning till och med utföras med en bredborrad 1000 μL pipettspets för att skopa och strö pärlor på celler, även om denna variation gör det svårt att strö ett monoskikt av pärlor på celler (steg 4.6).

En annan fördel med pärlbelastning är att celler kan behålla normal övergripande morfologi, återhämta sig snabbt och fortsätta att växa och dela, åtminstone för U2OS-, RPE1- och HeLa-cellerna som studeras här och för de andra cellinjerna som studeras någon annanstans (figur 3; Figur 4AB. Kompletterande video 1; tabell 1)31. Under pärlbelastningen utsätts cellerna för fysisk stress och ibland lossnar och skalas (~5 % av cellerna skalar under optimala förhållanden, men större cellförlust kan inträffa om pärlbelastning utförs för kraftfullt eller för många glaspärlor laddas ovanpå cellerna, som visas i figur 3B). Pärlor-laddade celler som förblir fästa vid täckglaset verkar dock vanligtvis friska och kan avbildas så snart som 30 minuter efter pärlbelastning (figur 3A). Vi tillåter i allmänhet celler en 30-minuters återhämtningsperiod men förväntar oss att avbildning tidigare post-pärla belastning är genomförbart.

En stor nackdel med denna teknik är att cellerna måste kunna motstå mindre fysisk stress under belastning och förbli säkert vidhäftande till täckglaset. Dåligt/icke-vidhäftande cellinjer eller celler som odlas på belagda plattor (t.ex. HEK och stamceller) lossnar ofta vid skonsam gängning vid lastning av pärlor. Vidare har erfarenhet visat att primära nervceller är för känsliga för pärlbelastning.

Pärlbelastning lämpar sig bäst för encelliga eller enmolekylsexperiment. Enligt vår erfarenhet har pärlbelastning en ungefär 20-40% proteinbelastningseffektivitet, och ~ 20% av pärlbelastade celler uttryckte också en co-loaded plasmid (Figur 2A, B). Således kan pärlbelastning av plasmider vara mindre effektiva för proteinuttryck än pärlbelastning av renade proteiner eftersom plasmider inte bara måste komma in i celler utan också uttryckas (vilket bland annat innebär kärnimport, transkription och översättning, som var och en kan sänka uttryckseffektiviteten). Den låga verkningsgraden hos pärlbelastad plasmiduttryck kan kringgås med hjälp av alternativa transfection-protokoll, såsom lipofection, innan pärla laddar proteiner ellersonder 16,27. Dessutom kan inkubation celler i optimala medier i 30 min före pärla belastning hjälpa plasmid uttryck. På grund av lågt plasmiduttryck har pärlbelastning inte ofta använts som ett alternativ till lipofection-baserad transfection i detta laboratorium. Det enda undantaget är när ett renat protein, som Fab, ska samladdas, i vilket fall det är ganska bekvämt att lasta proteinet och plasmid samtidigt. För celler som inte svarar eller är intoleranta mot lipofection kan dessutom pärlbelastning ge en alternativ, om än låg effektivitet, metod för övergående plasmiduttryck.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi är tacksamma mot medlemmarna i Stasevich-labbet för otaliga samtal som hjälpte till att förbättra och utveckla detta protokoll. Specifikt Dr. Linda Forero och Dr. Phil Fox för råd om pärla laddar olika celltyper. Vi vill uppriktigt tacka Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr Yuko Sato och Dr. Hiroshi Kimura för att dela deras glasplädladdningsprotokoll. Vi är mycket tacksamma mot Dr. Ashok Prasad och Dr Diego Krapf för att generöst dela sina pärlbelastningsprotokoll för att införa oorganiska partiklar i celler. Vi är tacksamma mot Dr. Travis Sanders, Craig Marshall och Dr. Thomas Santangelo för att generöst dela deras märkta RNA reagens. ALK, MNS, CAC, GG och TJS stöddes av National Institutes of Health (NIH) grant R35GM119728 och National Science Foundation (NSF) CAREER grant MCB-1845761, båda till TJS. CAC stöddes också av NSF NRT award DGE-1450032.

Materials

10 cm cell culture dishes VWR 82050-916 Use to culture cells
35 mm cell culture dishes Falcon 353001 Use to construct bead loader
Attofluor Cell Chamber Thermo Fisher Scientific A7816 Use to construct the custom bead loader
DMEM, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific 11960069 Use in general cell culture
Drierite Indicating Absorbents Thermo Fisher Scientific 07-578-3B Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets
Fetal Bovine Serum Atlas Biologics F-0050-A Use in general cell culture and as a supplement before bead loading
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* Millipore Sigma G4649 Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Seed cells onto these chambers for imaging
L-Glutamine-200 mM Thermo Fisher Scientific 25030081 Use to make DMEM + media
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step)
Parafilm VWR 52858-032 waxy film used to construct bead loader
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 Use to make DMEM + media
Phenol-free DMEM Thermo Fisher Scientific 31053036 Use on cells before imaging
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9625 Working stock of sterile 1X PBS
Sodium Hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific S318-500 Use 2 M solution to wash glass beads
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening Spectrum Labs 148496 Use to construct bead loader
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300062 Use in general cell culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
  2. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  3. Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
  4. Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
  5. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
  6. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
  7. Potter, H. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. 62 (1), 1-6 (2003).
  8. Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
  9. Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
  10. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
  11. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
  13. Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
  14. McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
  15. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
  16. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
  17. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  18. Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947 (2019).
  19. Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
  20. Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939 (2014).
  21. Pichon, X., Robert, M. -. C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
  22. Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
  23. Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
  24. Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120 (2020).
  25. Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
  26. Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
  27. Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
  28. JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , (2021).
  29. Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
  30. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  31. Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
  32. Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -. F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309 (2009).
  33. Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
  34. Emerson, N. T., Hsia, C. -. H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
  35. Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
  36. Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
  37. Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
  38. Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
  39. Jones, S. A., Shim, S. -. H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
  40. Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901 (2020).
  41. Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436 (2013).
  42. Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 91-102 (2018).

Tags

Bead LoadingAdherent CellsSingle Cell MicroscopyProteinsNucleic AcidsCell LoadingSodium HydroxideEthanolBiosafetyPolypropylene MeshUV SterilizationDesiccant
check_url/62559?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cialek, C. A., Galindo, G., Koch, A. L., Saxton, M. N., Stasevich, T. J. Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells. J. Vis. Exp. (172), e62559, doi:10.3791/62559 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image