Summary

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

Published: May 24, 2021
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Summary

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

Abstract

O AVC é a terceira causa mais comum de mortalidade e a principal causa de incapacidade adulta adquirida nos países desenvolvidos. Até o momento, as opções terapêuticas são limitadas a uma pequena proporção de pacientes com AVC nas primeiras horas após o AVC. Novas estratégias terapêuticas estão sendo amplamente investigadas, especialmente para prolongar a janela de tempo terapêutico. Essas investigações atuais incluem o estudo de importantes vias fisiodicosiológicas após o AVC, como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Na última década, tem havido uma preocupação crescente com a baixa reprodutibilidade dos resultados experimentais e os achados científicos entre grupos de pesquisa independentes. Para superar a chamada “crise de replicação”, são urgentemente necessários modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/), propõe-se um modelo padronizado de camundongos de oclusão de artéria cerebral média transitória (MCAo). Este modelo permite a restauração completa do fluxo sanguíneo após a remoção do filamento, simulando a lise de coágulos terapêutico ou espontâneo que ocorre em grande proporção de derrames humanos. O procedimento cirúrgico deste modelo de avc “filamento” e ferramentas para sua análise funcional são demonstrados no vídeo que acompanha.

Introduction

O AVC é uma das causas mais comuns de morte e incapacidade em todo o mundo. Embora existam principalmente duas formas distintas de derrame, isquêmicas e hemorrágicas, 80-85% de todos os casos de acidente vascular cerebral são isquêmicos1. Atualmente, apenas dois tratamentos estão disponíveis para pacientes com AVC isquêmico: tratamento farmacológico com ativador de plasmininogen de tecido recombinante (rtPA) ou trombio mecânica. No entanto, devido à estreita janela de tempo terapêutico e aos critérios de exclusão múltipla, apenas um número seleto de pacientes pode se beneficiar dessas opções específicas de tratamento. Nas últimas duas décadas, a pesquisa de AVC pré-clínico e translacional se concentrou no estudo de abordagens neuroprotetoras. No entanto, todos os compostos que atingiram os ensaios clínicos não apresentaram até agora melhorias para o paciente2.

Uma vez que os modelos in vitro não podem reproduzir com precisão todas as interações cerebrais e mecanismos fisiodicos do AVC, modelos animais são cruciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. No entanto, imitar todos os aspectos do AVC isquêmico humano em um único modelo animal não é viável, pois o AVC isquêmico é uma doença altamente complexa e heterogênea. Por essa razão, diferentes modelos de avc isquêmico foram desenvolvidos ao longo do tempo em diferentes espécies. Fototrombose de arteriolas cerebrais ou oclusão distal permanente da artéria cerebral média (MCA) são modelos comumente utilizados que induzem lesões pequenas e localmente definidas no neocórtex3,4. Além desses, o modelo de traçado mais usado é provavelmente o chamado “modelo de filamento”, no qual uma oclusão transitória de MCA é alcançada. Este modelo consiste em uma introdução transitória de um filamento de sutura à origem da AMC, levando a uma redução abrupta do fluxo sanguíneo cerebral e ao subsequente grande infarto das regiões cerebrais subcorticas e corticas5. Embora a maioria dos modelos de traçado imite oclusões MCA 6,o “modelo de filamento” permite a delimitação precisa do tempo isquêmico. A reperfusão por remoção de filamentos imita o cenário clínico humano de restauração do fluxo sanguíneo cerebral após espontâneo ou terapêutico (rtPA ou trombectomia mecânica) de lise de coágulos. Até o momento, foram descritas diferentes modificações deste “modelo de filamento”. Na abordagem mais comum, descrita pela primeira vez por Longa et al. em 19895, um filamento revestido de silício é introduzido através da artéria carótida comum (CCA) à origem da MCA7. Embora seja uma abordagem amplamente utilizada, este modelo não permite a restauração completa do fluxo sanguíneo durante a reperfusão, uma vez que a CCA é permanentemente ligada após a remoção do filamento.

Na última década, um número crescente de grupos de pesquisa tem se interessado em modelar o avc em camundongos usando este “modelo de filamento”. No entanto, a considerável variabilidade desse modelo e a falta de padronização dos procedimentos são algumas das razões para a alta variabilidade e baixa reprodutibilidade dos resultados experimentais e achados científicos relatados até agora2,8. Uma causa potencial da atual “crise de replicação”, referindo-se à baixa reprodutibilidade entre os laboratórios de pesquisa, são os volumes infartos não comparáveis entre grupos de pesquisa utilizando a mesma metodologia experimental9. De fato, após a realização do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizadopré-clínico 10,pudemos confirmar que a falta de padronização suficiente deste modelo experimental de AVC e os parâmetros de desfecho subsequentes foram as principais razões para a falha da reprodutibilidade em estudos pré-clínicos entre laboratórios independentes11 . Essas diferenças drásticas nos tamanhos de infarto resultantes, apesar de usarem o mesmo modelo de AVC, representam justificadamente não apenas uma ameaça à pesquisa confirmatória, mas também às colaborações científicas devido à falta de modelos robustos e reprodutíveis.

Diante desses desafios, buscamos desenvolver e descrever detalhadamente o procedimento para um modelo de MCAo transitório padronizado como utilizado para os esforços de pesquisa colaborativa dentro do consórcio de pesquisa “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). Este consórcio tem como objetivo entender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC. Além disso, são apresentados métodos funcionais histológicos e relacionados para análise de desfechos de acidente vascular cerebral. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão estabelecidos utilizados em todos os laboratórios de pesquisa do consórcio ImmunoStroke.

Protocol

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados seguindo as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Camundongos C57Bl/6J machos de dez semanas de idade foram usados e abrigados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água. 1. Preparação do material e inst…

Representative Results

O modelo descrito aqui é uma modificação do modelo de traçado de “filamento” comumente utilizado, que consiste em introduzir um filamento revestido de silício através do ECA para bloquear transitoriamente a origem da MCA (Figura 1). Após a remoção do filamento, apenas o fluxo sanguíneo no TCE é permanentemente cessado, permitindo a recanalização completa do CCA e do ICA. Isso permite uma reperfusão adequada do cérebro (Figura 2), semelhante à sit…

Discussion

O presente protocolo descreve um modelo experimental de avc baseado no acordo de consenso de um consórcio alemão de pesquisa multicêntrico (“ImmunoStroke”) para estabelecer um modelo de MCAo transitório padronizado. O modelo transitório de MCAo estabelecido pela introdução de um filamento revestido de silício através do ECA até a origem do MCA é um dos modelos de traçado mais utilizados para alcançar a reperfusão arterial após um período de oclusão delimitado. Portanto, este procedimento pode ser conside…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os nossos parceiros de colaboração do ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, das células imunes à recuperação do AVC) por sugestões e discussões. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha no âmbito do Cluster de Munique para Neurologia de Sistemas (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) e sob as bolsas LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.1.

Materials

45° ramp H&S Kunststofftechnik height: 18 cm
5/0 threat Pearsalls 10C103000
5 mL Syringe Braun
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
Bepanthen pomade Bayer
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Clamp FST 12500-12
Clip FST 18055-04
Clip holder FST 18057-14
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filaments Doccol 602112PK5Re
Fine 45 angled forceps FST 11251-35
Fine forceps FST 11252-23
Fine Scissors FST 14094-11
Glue Orechseln BSI-112
Hardener Glue Drechseln & Mehr BSI-151
Heating blanket FHC DC Temperature Controller
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler Perimed PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe Perimed 91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Recovery chamber Mediheat
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Scalpel Feather 02.001.30.011
Silicon-coated filaments Doccol 602112PK5Re
Stereomicropscope Leica M80
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors FST 15000-00
Xylacine Albrecht

References

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Cite This Article
Llovera, G., Simats, A., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery. J. Vis. Exp. (171), e62573, doi:10.3791/62573 (2021).

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