שבץ דוגמנות בעכברים: אומת עורק מוחי אמצעי חולף דרך העורק הראשי החיצוני
Summary
מודלים שונים של אומת עורק המוח האמצעי (MCAo) משמשים במחקר שבץ ניסיוני. כאן, מודל שבץ ניסיוני של MCAo חולף דרך העורק הראשי החיצוני (ECA) מתואר, שמטרתו לחקות שבץ אנושי, שבו פקקת המוח מוסרת עקב תמוגה קריש ספונטני או טיפול.
Abstract
שבץ מוחי הוא הגורם השלישי בשכיחותו לתמותה והגורם המוביל לנכות בוגרת שנרכשה במדינות המפותחות. עד כה, אפשרויות טיפוליות מוגבלות לחלק קטן של חולי שבץ בשעות הראשונות לאחר השבץ. אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נחקרות בהרחבה, במיוחד כדי להאריך את חלון הזמן הטיפולי. חקירות נוכחיות אלה כוללות את המחקר של מסלולים פתופיציולוגיים חשובים לאחר שבץ, כגון דלקת לאחר שבץ, אנגיוגנזה, פלסטיות עצבית, והתחדשות. בעשור האחרון גובר החשש מפני שכפול לקוי של תוצאות ניסוי וממצאים מדעיים בקרב קבוצות מחקר עצמאיות. כדי להתגבר על מה שמכונה “משבר השכפול”, יש צורך דחוף במודלים סטנדרטיים מפורטים לכל ההליכים. כמאמץ בתוך קונסורציום המחקר “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/), מוצע מודל עכבר סטנדרטי של נעילת עורק המוח האמצעי החולף (MCAo). מודל זה מאפשר שחזור מלא של זרימת הדם עם הסרת חוט, המדמה את תמוגת קריש הדם הטיפולית או הספונטנית המתרחשת בחלק גדול של שבץ אנושי. ההליך הכירורגי של מודל שבץ “חוט” זה וכלים לניתוח הפונקציונלי שלו מוצגים בסרטון המצורף.
Introduction
שבץ מוחי הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות ונכות ברחבי העולם. למרות שיש בעיקר שתי צורות שונות של שבץ, איסכמי ודימומי, 80-85% מכלל מקרי השבץ הם איסכמיים1. נכון לעכשיו, רק שני טיפולים זמינים עבור חולים עם שבץ איסכמי: טיפול תרופתי עם מפעיל פלסמינוגן רקמה רקומביננטי (rtPA) או פקקת מכנית. עם זאת, בשל חלון הזמן הטיפולי הצר וקריטריוני אי הכללה מרובים, רק מספר נבחר של חולים יכולים ליהנות מאפשרויות טיפול ספציפיות אלה. במהלך שני העשורים האחרונים, מחקר שבץ פרה-אקליני ותרגום התמקד בחקר גישות נוירו-הגנתיות. עם זאת, כל התרכובות שהגיעו לניסויים קליניים לא הראו עד כה שיפורים עבור המטופל2.
מכיוון שמודלים במבחנה אינם יכולים לשחזר במדויק את כל האינטראקציות במוח ומנגנונים פתולוגיים של שבץ, מודלים של בעלי חיים חיוניים למחקר שבץ פרה-אקליני. עם זאת, חיקוי כל ההיבטים של שבץ איסכמי אנושי במודל של חיה אחת אינו ריאלי, שכן שבץ איסכמי הוא מחלה מורכבת והטרוגנית מאוד. מסיבה זו, מודלים שונים של שבץ איסכמי פותחו לאורך זמן במינים שונים. פוטוטרומבוזיס של עורקים מוחיים או חסם דיסטלי קבוע של העורק המוחי האמצעי (MCA) הם מודלים נפוצים הגורמים נגעים קטנים ומוגדרים באופן מקומי בנאוקורטקס3,4. מלבד אלה, מודל השבץ הנפוץ ביותר הוא כנראה מה שנקרא “מודל חוט”, שבו מושגת אוסם חולף של MCA. מודל זה מורכב מהקדמה חולפת של חוט תפירה למקור ה- MCA, מה שמוביל לירידה פתאומית של זרימת הדם במוח ולאוטם הגדול הבא של אזורי מוח תת-קורטיקליים וקליפתיים5. למרות שרוב דגמי השבץ מחקים את החסימות של MCA 6, “מודל הסיב” מאפשר תיחום מדויק של הזמן האיסכמי. רפרפוזיה על ידי הסרת חוט מחקה את התרחיש הקליני האנושי של שחזור זרימת הדם המוחי לאחר ספונטני או טיפולי (rtPA או פקקת מכנית) תמיסת קריש. עד כה תוארו שינויים שונים של “מודל חוט” זה. בגישה הנפוצה ביותר, שתואר לראשונה על ידי לונגה ואח‘. בשנת 19895,חוט מצופה סיליקון מוצג דרך העורק הראשי המשותף (CCA) למקורו של MCA7. למרות שזו גישה נפוצה, מודל זה אינו מאפשר שיקום מלא של זרימת הדם במהלך reperfusion, כמו CCA הוא קשור לצמיתות לאחר הסרת חוט.
בעשור האחרון, מספר גדל והולך של קבוצות מחקר התעניינו בדוגמנות שבץ בעכברים באמצעות “מודל חוט” זה. עם זאת, השונות ניכרת של מודל זה וחוסר התקינה של ההליכים הם חלק מהסיבות לשונות גבוהה ולשחזור לקוי של תוצאות הניסוי והממצאים המדעיים שדווחו עד כה2,8. גורם פוטנציאלי ל”משבר השכפול” הנוכחי, בהתייחסו להתרבות הנמוכה בקרב מעבדות המחקר, הוא נפחי אוטם השבץ הלא-דומים בין קבוצות מחקר המשתמשות באותה מתודולוגיה ניסיונית9. למעשה, לאחר ביצוע הראשון אקראי אקראי מבוקר ניסוי מחקרmulticenter 10, הצלחנו לאשר כי חוסר סטנדרטיזציה מספקת של מודל שבץ ניסיוני זה ואת הפרמטרים התוצאה הבאים היו הסיבות העיקריות לכישלון רבייה במחקרים פרה קליניים בין מעבדות עצמאיות11 . הבדלים דרסטיים אלה בגדלים האוטם הנובעים מכך, למרות השימוש באותו מודל שבץ, מהווים בצדק לא רק איום על מחקר מאשר, אלא גם על שיתופי פעולה מדעיים בשל היעדר מודלים חזקים וניתן לשחזור.
לאור אתגרים אלה, אנו שואפים לפתח ולתאר בפירוט את ההליך למודל MCAo ארעי סטנדרטי המשמש למאמצי המחקר השיתופיים בתוך קונסורציום המחקר “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). קונסורציום זה נועד להבין את האינטראקציות בין המוח לחיסון שבבסיס העקרונות המכניסטיים של התאוששות שבץ. בנוסף, מוצגות שיטות היסתולוגיות ופונקציונליות הקשורות לניתוח תוצאות שבץ. כל השיטות מבוססות על נהלי הפעלה סטנדרטיים שנקבעו המשמשים בכל מעבדות המחקר של קונסורציום ImmunoStroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל שבץ ניסיוני המבוסס על הסכם הקונצנזוס של קונסורציום מחקר רב מרכזי גרמני (“ImmunoStroke”) כדי להקים מודל MCAo ארעי סטנדרטי. מודל MCAo החולף שהוקם על ידי החדרת חוט מצופה סיליקון דרך ECA למקור ה- MCA הוא אחד מדגמי השבץ הנפוצים ביותר להשגת רפרופוזיה עורקית לאחר תקופת חסימה מופרדת. ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל שותפינו לשיתוף הפעולה של קונסורציום ImmunoStroke (עבור 2879, מתאי מערכת החיסון ועד לשחזור שבץ) על הצעות ודיונים. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה של מערכות (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) ותחת המענקים LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 ו- LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
