نحن هنا نقدم إجراء لقياس أوليغومر البروتين والتجميع في الخلايا lysate والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي ارتباط مضان.
تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD) وما إلى ذلك. للكشف عن وتحليل أوليغومرات البروتين القابلة للذوبان أو المنتشرة أو المجاميع ، تم استخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يمكنه اكتشاف سرعة الانتشار وسطوع جسيم واحد مع حساسية جزيء واحد. ومع ذلك، لم يتم تقاسم الإجراءات والدراية المناسبة للكشف عن تجميع البروتين على نطاق واسع. هنا ، نعرض إجراء قياسيا لقياس FCS لخصائص الانتشار للبروتينات المعرضة للتراكم في lysate الخلية والخلايا الحية: ALS المرتبطة 25 kDa carboxyl-terminal جزء من TAR DNA / الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين 43 كيلودا (TDP25) وdismutase أكسيد 1 (SOD1). تظهر النتائج التمثيلية أن جزءا من مجاميع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم TDP25 تم تضمينه قليلا في الكسر القابل للذوبان من تحلل خلية الورم الأرومي العصبي المورفين Neuro2a. وعلاوة على ذلك ، GFP الموسومة SOD1 تحمل الطفرة المرتبطة ALS يظهر انتشار أبطأ في الخلايا الحية. وبناء على ذلك، نحن هنا نقدم الإجراء للكشف عن تجميع البروتين عن طريق خاصية نشرها باستخدام FCS.
تجمعات البروتين التي تنطوي على اضطرابات عصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, وهلم جرا1 ومن المعروف أن تكون سامة ومن شأنها أن تزعج التوازن البروتين (البروتيوستاسي) في الخلايا والأعضاء, التي يمكن أن تؤدي بعد ذلك إلى الشيخوخة2. ومن المتوقع إزالة البروتين تجميع كاستراتيجية علاجية; ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد المواد الكيميائية التي تمنع تكوين البروتين وتتحلل مجاميع البروتين (مثل الجزيئات الصغيرة أو الأدوية). وعلاوة على ذلك، فإن كيفية ممارسة تجميع البروتين للسمية لا تزال بعيدة المنال. لذلك ، لتعزيز المشاريع البحثية المتعلقة بتجميع البروتين ، من المهم إدخال إجراءات عالية الإنتاجية للكشف ببساطة عن تجميع البروتين. الكشف عن تجميع البروتين باستخدام الأجسام المضادة التعرف على تشكيل تجميع البروتين وصبغ الفلورسنت تجميع محددة وقد استخدمت على نطاق واسع3. ومع ذلك ، من الصعب الكشف عن التجميع ، خاصة في الخلايا الحية باستخدام مثل هذه الإجراءات الكلاسيكية.
Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) هو إجراء للكشف عن تجميع البروتين والتغيير الهيكلي. ومع ذلك ، فإن FRET غير قادر على تحليل ديناميات البروتين (على سبيل المثال ، نشر وoligomerization البروتين في الخلايا الحية)3. لذلك ، نقدم هنا بروتوكولا بسيطا للكشف عن تجميع البروتين في المحلول (على سبيل المثال ، lysate الخلية) والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يقيس خاصية الانتشار وسطوع جزيئات الفلورسنت مع حساسية جزيء واحد4. FCS هو طريقة العد الضوئي باستخدام المجهر confocal مسح الليزر (LSM). باستخدام كاشف فوتون حساس للغاية وحساب وظيفة التصحيح التلقائي (ACF) لوقت وصول الفوتون ، يتم قياس المرور عبر الوقت وسطوع جزيئات الفلورسنت في حجم الكشف. الانتشار يبطئ مع زيادة الوزن الجزيئي. وبالتالي، يمكن تقدير التفاعل بين الجزيئات باستخدام FCS. حتى أكثر قوة، زيادة في سطوع جزيء الفلورسنت يشير إلى المثلية-oligomerization من الجزيئات. ولذلك، FCS هو أداة قوية للكشف عن مثل هذا التجمع البروتين.
وفيما يتعلق بمعايرة النظام قبل القياسات، ينبغي استخدام نفس الأواني الزجاجية المستخدمة لقياس العينة (على سبيل المثال، تغطي الآبار الثمانية الحجرة الزجاجية لليسات الخلية وطبق الأساس الزجاجي للخلايا الحية مقاس 35 ملم). بسبب الامتزاز من Rh6G على الزجاج، قد ينخفض تركيزها الفعال في بعض الأحيان. ?…
The authors have nothing to disclose.
11- وتحظى منظمة “A.K. ” بدعم من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة في المعونة لأغراض البحث العلمي (C) (#18K06201)، ومنحة معونة من مؤسسة ناكاتاني للتدابير المضادة ضد العدوى الجديدة بالفيروس التاجي، ومنحة من مكتب جامعة هوكايدو لتطوير قادة بحوث المستقبل (L-Station)، ومنحة مساعدة من مؤسسة هوانشا. 10 – وتحظى م. ك. بدعم جزئي من منحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات الابتكارية “كيمياء النظم الحيوية المتعددة الجزيئات التي تزاحم” (#20H04686)، ومنحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات المبتكرة “فيزياء المعلومات للمسائل المعيشية” (#20H05522).
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |