Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence
Summary
Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.
Abstract
L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (MH), et ainsi de suite. Pour détecter et analyser les oligomers ou agrégats protéiques solubles ou diffus, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui peut détecter la vitesse de diffusion et la luminosité d’une seule particule avec une seule sensibilité molécule, a été utilisée. Cependant, la procédure et le savoir-faire appropriés pour la détection de l’agrégation des protéines n’ont pas été largement partagés. Ici, nous montrons une procédure standard de mesure fcs pour les propriétés de diffusion des protéines sujettes à l’agrégation dans le lysate cellulaire et les cellules vivantes : fragment carboxyl-terminal associé à la SLA de l’ADN TAR/protéine liant l’ARN 43 kDa (TDP25) et de la dismutase de superoxyde 1 (SOD1). Les résultats représentatifs montrent qu’une partie des agrégats de protéine fluorescente verte (GFP) marqué TDP25 a été légèrement inclus dans la fraction soluble du lysate cellulaire neuroblastome murin Neuro2a. En outre, le SOD1 marqué GFP portant la mutation ALS-associée montre une diffusion plus lente dans les cellules vivantes. En conséquence, nous introduisons ici la procédure de détection de l’agrégation protéique via sa propriété de diffusion à l’aide de FCS.
Introduction
Les agrégations protéiques impliquant des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, etainsi de suite, sont connues pour être toxiques et perturberaient l’homéostasie protéique (protéostasie) dans les cellules et les organes, qui pourrait alors conduire au vieillissement2. Le dégagement de l’agrégation protéique est attendu comme stratégie thérapeutique; toutefois, les produits chimiques qui empêchent la formation d’agrégations protéiques et dégradent les agrégats protéiques (p. ex., petites molécules ou médicaments) n’ont pas encore été établis. De plus, la façon dont l’agrégation protéique exerce une toxicité reste insaisissable. Par conséquent, pour promouvoir des projets de recherche liés à l’agrégation des protéines, il est important d’introduire des procédures à haut débit pour détecter simplement l’agrégation des protéines. La détection de l’agrégation protéique à l’aide d’anticorps reconnaissant la conformation de l’agrégation protéique et du colorant fluorescent spécifique à l’agrégation a étélargement utilisée 3. Cependant, il est difficile de détecter l’agrégation, en particulier dans les cellules vivantes en utilisant de telles procédures classiques.
Le transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) est une procédure de détection de l’agrégation des protéines et des changements structurels. Toutefois, fret est incapable d’analyser la dynamique protéique (p. ex., diffusion et oligomérisation des protéines dans les cellules vivantes)3. Par conséquent, nous introduisons ici un protocole simple pour détecter l’agrégation des protéines dans la solution (par exemple, le lysate cellulaire) et les cellules vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui mesure la propriété de diffusion et la luminosité des molécules fluorescentes avec une seule sensibilité molécule4. FCS est une méthode de comptage des photons à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSM). À l’aide d’un détecteur de photons hautement sensible et du calcul de la fonction d’autocorrépendance (ACF) de l’heure d’arrivée des photons, le passage à travers le temps et la luminosité des molécules fluorescentes dans le volume de détection est mesuré. La diffusion ralentit avec une augmentation du poids moléculaire; ainsi, l’interaction intermoléculaire peut être estimée à l’aide de FCS. Plus puissamment encore, une augmentation de la luminosité de la molécule fluorescente indique l’homo-oligomérisation des molécules. Par conséquent, FCS est un outil puissant pour détecter une telle agrégation de protéines.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ce qui concerne l’étalonnage du système avant les mesures, les mêmes verreries que celle utilisée pour mesurer l’échantillon devraient être utilisées (p. ex., les 8 puits couvrent la chambre de verre pour le lysate cellulaire et le plat de base en verre de 35 mm pour les cellules vivantes). En raison de l’adsorption de Rh6G sur le verre, sa concentration effective peut parfois diminuer. Si c’est le cas, une solution Rh6G hautement concentrée comme 1 μM doit être utilisée juste pour le réglage du st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. a été soutenu par une subvention de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), par une subvention de la Fondation Nakatani pour la lutte contre les nouvelles infections coronavirus, par une subvention du Bureau de l’Université d’Hokkaido pour le développement des futurs leaders de la recherche (L-Station), et une subvention d’aide de la Fondation Hoansha. M. K. a été partiellement soutenu par une subvention du JSPS pour la recherche scientifique sur les domaines novateurs « Chimie pour biosystèmes d’entassement multimoléculaire » (#20H04686) et une subvention de la JSPS pour la recherche scientifique sur les domaines novateurs « Physique de l’information des questions vivantes » (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
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