Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции
Summary
Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.
Abstract
Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.
Introduction
Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, итак далее 1, как известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести кстарению 2. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым. Поэтому для продвижения исследовательских проектов, связанных с агрегацией белка, важно ввести процедуры высокой пропускной способности, чтобы просто обнаружить агрегацию белка. Обнаружение агрегации белка с использованием антител, распознающих конформацию агрегации белка и агрегации специфических флуоресцентных красителей широко используется3. Однако, трудно обнаружить агрегацию, особенно в живых клетках с помощью таких классических процедур.
Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET) является процедура для обнаружения агрегации белка и структурных изменений. Тем не менее, FRET не в состоянии анализировать белковую динамику (например, диффузию и олигомеризацию белка в живых клетках)3. Поэтому мы вводим здесь простой протокол для обнаружения агрегации белка в растворе (например, лисате клеток) и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии (FCS), которая измеряет диффузионные свойства и яркость флуоресцентных молекул с однойчувствительностью молекулы 4. FCS — это метод фотон-подсчета с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа (LSM). Используя высокочувствительный фотон-детектор и расчет функции автокорреляции (ACF) времени прибытия фотона, измеряется проход во времени и яркость флуоресцентных молекул в объеме обнаружения. Диффузия замедляется с увеличением молекулярного веса; таким образом, интермолекулярное взаимодействие можно оценить с помощью FCS. Еще мощнее, увеличение яркости флуоресцентной молекулы указывает на гомо-олигомеризацию молекул. Таким образом, FCS является мощным инструментом для обнаружения такой агрегации белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная конце?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
А.К. был поддержан Японского общества содействия науке (JSPS) Грант-в-помощи для научных исследований (C) (#18K06201), грант в помощь от Фонда Накатани по борьбе с новыми коронавирусных инфекций, грант от Университета Хоккайдо Управление по развитию будущих лидеров исследований (L-Station), а также грант в помощь от Hoansha Фонда. М.К. была частично поддержана грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей “Химия для многомолекулярных краудинговых биосистем” (#20H04686) и грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей “Информационная физика живых дел” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
