Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Summary

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Abstract

Le membrane cellulari modello sono un utile strumento di screening con applicazioni che vanno dalla scoperta precoce di farmaci agli studi di tossicità. La membrana cellulare è una barriera protettiva cruciale per tutti i tipi di cellule, separando i componenti cellulari interni dall’ambiente extracellulare. Queste membrane sono composte in gran parte da un doppio strato lipidico, che contiene gruppi di testa idrofili esterni e gruppi di coda idrofobici interni, insieme a varie proteine e colesterolo. La composizione e la struttura dei lipidi stessi svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della funzione biologica, comprese le interazioni tra le cellule e il microambiente cellulare, che può contenere farmaci, tossine biologiche e sostanze tossiche ambientali. In questo studio, vengono descritti metodi per formulare cellule uni-lipidiche e multi-lipidiche supportate e sospese che imitano i doppi strati lipidici. In precedenza, sono stati sviluppati doppi strati lipidici uni-lipidici di fosfatidilcolina (PC) e doppi strati lipidici ispirati al trofoblasto placentare multilipidico per l’uso nella comprensione delle interazioni molecolari. Qui verranno presentati i metodi per ottenere entrambi i tipi di modelli a doppio strato. Per le cellule che imitano i doppi strati multilipidici, la composizione lipidica desiderata viene prima determinata tramite estrazione lipidica da cellule primarie o linee cellulari seguita da cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Utilizzando questa composizione, le vescicole lipidiche vengono fabbricate utilizzando un metodo di idratazione ed estrusione a film sottile e il loro diametro idrodinamico e il potenziale zeta sono caratterizzati. I doppi strati lipidici supportati e sospesi possono quindi essere formati utilizzando la microbilancia di cristallo di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D) e su una membrana porosa per l’uso in un saggio di permeabilità della membrana artificiale parallela (PAMPA), rispettivamente. I risultati rappresentativi evidenziano la riproducibilità e la versatilità dei modelli lipidici a doppio strato di membrana cellulare in vitro. I metodi presentati possono aiutare nella valutazione rapida e facile dei meccanismi di interazione, come la permeazione, l’adsorbimento e l’incorporamento, di varie molecole e macromolecole con una membrana cellulare, aiutando nello screening dei farmaci candidati e nella previsione della potenziale tossicità cellulare.

Introduction

La membrana cellulare, composta principalmente da fosfolipidi, colesterolo e proteine, è un componente cruciale di tutte le cellule viventi¹. Con l’organizzazione guidata dall’anfifilicità lipidica, la membrana cellulare funziona come una barriera protettiva e regola il modo in cui la cellula interagisce con l’ambiente circostante². Diversi processi cellulari dipendono dalla composizione lipidica e proteica della membrana^1,2. Ad esempio, le interazioni della membrana cellulare sono importanti per un’efficace somministrazione di farmaci³. Prodotti farmaceutici, biologici, nanomateriali, tossine biologiche e sostanze tossiche ambientali possono influire sull’integrità di una membrana cellulare, influenzando così la funzione cellulare⁴. La costruzione di modelli di membrana che imitano le cellule in vitro basati sulla composizione lipidica delle membrane cellulari ha il potenziale per fornire strumenti facili per migliorare notevolmente lo studio del potenziale impatto di questi materiali sulle cellule.

I doppi strati lipidici modello includono vescicole lipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. I doppi strati lipidici supportati sono un modello della membrana cellulare fosfolipidica comunemente usata nelle applicazioni biotecnologiche in cui le vescicole lipidiche vengono rotte su un materiale di substrato supportato^5,6,7,8,9. Una tecnica comune utilizzata per monitorare la formazione di doppio strato è la microbilancia a cristallo di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D), che esamina l’adsorbimento delle vescicole rispetto alle proprietà liquide sfuse in situ^{8,10,11, 12,13,14} . In precedenza, QCM-D è stato utilizzato per dimostrare che in condizioni di flusso, una volta che una copertura critica delle vescicole delle vescicole lipidiche di fosfatidilcolina (PC) è raggiunta sulla superficie, si rompono spontaneamente in rigidi doppi strati lipidici¹⁵. Lavori precedenti hanno anche studiato la formazione di doppi strati lipidici supportati con composizioni lipidiche variabili^16,l’incorporazione di proteine lipidiche^{17, 18,19}e l’utilizzo di cuscini polimerici^20,producendo doppi strati lipidici supportati in grado di imitare vari aspetti della funzione della membrana cellulare.

I doppi strati lipidici sono stati utilizzati per imitare varie barriere biologiche dai livelli subcellulari a quelli degli organi, tra cui mitocondrio, globuli rossi e membrane delle cellule epatiche alterando i componenti fosfolipidi, colesterolo e glicolipidi^21. Queste vescicole multilipidiche più complesse possono richiedere metodi aggiuntivi per ottenere la rottura delle vescicole, a seconda della composizione lipidica. Ad esempio, studi precedenti hanno utilizzato un peptide α-elicoidale (AH) derivato dalla proteina non strutturale 5A del virus dell’epatite C per indurre la formazione di doppio strato destabilizzando le vescicole lipidiche adsorbite^22,23. Utilizzando questo peptide AH, i doppi strati lipidici supportati che imitano le cellule placentari sono stati precedentemente formati²⁴. Il grande potenziale dei doppi strati lipidici supportati per applicazioni biomediche è stato dimostrato con indagini che abbracciano il trasporto molecolare e delle nanoparticelle^25,26,le interazioni tossicorie ambientali^27,l’assemblaggio e la funzione proteica^17,18,19,la disposizione e l’inserimento dei peptidi^28,29,lo screening farmacologico³⁰e le piattaforme microfluidiche^31.

I doppi strati lipidici sospesi sono stati utilizzati per studi di screening farmaceutico tramite un test parallelo di permeabilità della membrana artificiale (PAMPA) in cui un doppio strato lipidico è sospeso attraverso un inserto idrofobico poroso^32,33,34,35. Sono stati sviluppati modelli lipidici PAMPA per diverse interfacce biologiche tra cui le interfacce sangue-cervello, buccale, intestinale e transdermica³⁶. Combinando le tecniche a doppio strato lipidico supportate e PAMPA, è possibile studiare a fondo l’adsorbimento, la permeabilità e l’incorporazione di composti all’interno dei componenti lipidici di un tessuto o di un tipo di cellula desiderato.

Questo protocollo descrive la fabbricazione e l’applicazione di modelli lipidici a doppio strato di membrana cellulare in vitro per studiare diverse interazioni molecolari. La preparazione di entrambi i doppi strati lipidici e multilipidici supportati e sospesi è dettagliata. Per formare un doppio strato lipidico supportato, le vescicole lipidiche vengono prima sviluppate utilizzando metodi di idratazione ed estrusione a film sottile seguiti da caratterizzazione fisico-chimica. Viene discussa la formazione di un doppio strato lipidico supportato utilizzando il monitoraggio QCM-D e la fabbricazione di membrane lipidiche sospese per l’uso in PAMPA. Infine, vengono esaminate vescicole multilipidiche per lo sviluppo di membrane che imitano cellule più complesse. Utilizzando entrambi i tipi di membrane lipidiche fabbricate, questo protocollo dimostra come questo strumento possa essere utilizzato per studiare le interazioni molecolari. Nel complesso, questa tecnica costruisce cellule che imitano i doppi strati lipidici con elevata riproducibilità e versatilità.

Protocol

1. Sviluppo di vescicole uni-lipidiche Metodo di idratazione a film sottile Preparazione e conservazione di soluzioni lipidicheNOTA: Tutti i passaggi che utilizzano il cloroformio devono essere eseguiti in una cappa aspirante chimica. Il cloroformio deve sempre essere pipettato utilizzando punte per pipette in fibra di carbonio sicure per solventi. Le soluzioni contenenti cloroformio devono essere sempre conservate in flaconcini di vetro. Preparare una soluzione madre lipidica da 10 mg/mL ag…

Representative Results

Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi per la formazione di doppi strati lipidici supportati e sospesi (Figura 1). Il primo passo per formare un doppio strato lipidico supportato è quello di sviluppare vescicole lipidiche. Il mini estrusore consente di preparare piccoli volumi di vescicole lipidiche (1 mL o meno), mentre il grande estrusore consente di preparare 5-50 mL di vescicole lipidiche in un unico lotto. Le distribuzioni dimensionali delle vescicole unilipidiche formate dal…

Discussion

Questo protocollo consente la formazione di vescicole lipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Qui vengono presentati i passaggi critici per formare ciascuna di queste strutture. Quando si formano vescicole lipidiche, è importante estrudere al di sopra della temperatura di transizione del lipide³⁹. Quando è al di sotto della temperatura di transizione, il lipide è fisicamente presente nella sua fase gel ordinata³⁹. In questa fase ordin…

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)	Avanti Polar Lipids	850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)	Avanti Polar Lipids	850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))	Avanti Polar Lipids	890703
3 mL Luer-Loc syringes	BD	309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner	Duran Wheaton Kimble	W224605
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Alconox	Fisher Scientific	50-821-781
Ammonium formate	Millipore Sigma	LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire	Waters	186002551
Chloroform	Millipore Sigma	LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK	Sarstedt	67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)	Millipore Sigma	36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	LSAC472301
Ethanol	Pharmco	111000200
Filter supports, 10 mm	Avanti Polar Lipids	610014	Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell	Malvern Panalytical	DTS1070
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764-4L
Kimwipes	Kimberly Clark	34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)	Avanti Polar Lipids	840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051
LiposoFast ® LF-50	Avestin, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337 – 4L
Mini-extruder set with holder/heating block	Avanti Polar Lipids	610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile	Millipore Sigma	MAIPS4510	for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure	TechAir	NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um	Whatman	800309	Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um	Whatman	110605	Size for large extruder
Parafilm	Bemis	PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x	Genesee Scienfitic	25-507X	Dilute to 1x
Qsoft 401 software	Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer	Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL	Duran Wheaton Kimble	986561
Silicon Dioxide, thin QSensors	Biolin Scientific	QSX 303
Sodium chloride (NaCl)	Millipore Sigma	LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-100
Solvent Safe pipette tips	Sigma-Aldrich	S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	860061
Trizma base	Millipore Sigma	LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid	Caisson Labs	TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm	Whatman	230600	Size for large extruder
Zetasizer ZS90	Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software	Malvern Panalytical