Summary

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.

Abstract

Der endosomale Transport ist ein essentieller zellulärer Prozess, der eine breite Palette biologischer Ereignisse reguliert. Proteine werden aus der Plasmamembran internalisiert und dann zu den frühen Endosomen transportiert. Die internalisierten Proteine könnten zum Abbau in das Lysosom überführt oder zur Plasmamembran zurückgeführt werden. Ein robuster endozytärer Recyclingweg ist erforderlich, um die Entfernung von Membranmaterialien aus der Endozytose auszugleichen. Es wird berichtet, dass verschiedene Proteine den Signalweg regulieren, einschließlich ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6). Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist eine klassische Methode zur Zellfraktionierung. Nach der Zentrifugation werden Organellen an ihrer isopyknen Oberfläche sedimentiert. Die Fraktionen werden gesammelt und für andere nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Gewinnung einer Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die isolierten Fraktionen wurden zur Analyse ihres Proteingehalts einem Standard-Western-Blotting unterzogen. Durch die Anwendung dieser Methode identifizierten wir, dass die Plasmamembran, die auf Engulfment und Zellmotilität 1 (ELMO1), einen Ras-verwandten C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1) Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, abzielt, durch ARF6-vermitteltes endozytäres Recycling erfolgt.

Introduction

Der endosomale Transport ist ein essentieller physiologischer Prozess, der verschiedene biologische Ereignisse1impliziert, z. B. den Transport von Signalrezeptoren, Ionenkanälen und Adhäsionsmolekülen. Proteine, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, werden durch Endozytoseinternalisiert 2. Die internalisierten Proteine werden dann nach dem frühen Endosom3sortiert. Einige der Proteine zielen auf Lysosomen zum Abbau ab4. Eine beträchtliche Menge an Proteinen wird jedoch durch schnelles Recycling und langsame Recyclingprozesse wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt. Beim schnellen Recycling verlassen Proteine die frühen Endosomen und kehren direkt zur Plasmamembran zurück. Umgekehrt werden beim langsamen Recycling Proteine zunächst in das endozytäre Recyclingkompartiment sortiert und dann zurück zur Plasmamembran transportiert. Verschiedene Frachtproteine, zum Beispiel Clathrin, Retromerkomplex, Retrieverkomplex und Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein sowie SCAR Homologue (WASH) -Komplex, nehmen an solchen Membranrecyclingprozessenteil 4,5,6,7,8,9. Das Gleichgewicht der Endozytose und des Recyclingereignisses ist entscheidend für das Überleben der Zelle und trägt zu verschiedenen zellulären Ereignissen10bei, z. B. Zelladhäsion, Zellmigration, Zellpolarität und Signaltransduktion.

ARF6, eine kleine GTPase, ist ein berichteter Regulator des endozytären Transports7,11,12. Interessant ist, dass verschiedene Forschungsgruppen die Bedeutung von ARF6 für das endozytäre Recycling13,14,15,16,17aufgezeigthaben. Die Studie zielt darauf ab, den Zusammenhang zwischen ARF6-vermitteltem Neuritenauswuchs und endozytärem Recycling zu untersuchen. Der vorherige Bericht legt nahe, dass die Aktivierung von ARF6 der Rac1-Aktivität vorgelagert ist, indem sie auf den ELMO1-Dedikator des Zytokinese-1-Komplexes (DOCK180)18einwirkt. Wie ARF6 jedoch die ELMO1-DOCK180-vermittelte Rac1-Signalisierung auslöst, bleibt unklar. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurde eingesetzt, um die Rolle des ARF6-vermittelten endozytären Recyclings in einem solchen Prozess zu untersuchen. Auf diese Weise wurde die Recycling-Endosomen-haltige Fraktion aus Zelllysaten19erhalten. Die Fraktion wurde für die Proteingehaltsanalyse einem Western Blotting unterzogen. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass unter Der Anwesenheit von FE65, einem mit dem Gehirn angereicherten Adapterprotein, aktives ARF6 den Gehalt an ELMO1 in der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion erheblich erhöhte. Das folgende Protokoll enthält die Verfahren für (1) die Transfektionierung von Säugetierzellen; (2) Vorbereitung der Proben und Dichtegradientensäulen; und (3) Gewinnung der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion.

Protocol

1. Zellkultur und Transfektion von Säugetieren Platte 2 x 106 Zellen in einer 100 mm Kulturschale. Verwenden Sie vier Gerichte für jede Transfektion.HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen kann für verschiedene Zelllinien variieren. Möglicherweise ist eine Optimierung erforderlich, bevor Sie mit dem Isolationsschritt fortfahren. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers. 2. Zellernte …

Representative Results

Nach der Fraktionierung der nicht transfizierten HEK293-Zellen durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurden 12 Brüche von der Spitze des Gradienten gesammelt. Die geernteten Fraktionen wurden mit dem Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:1 verdünnt und einer zweiten Zentrifugationsrunde unterzogen. Die Proben wurden dann einem Western Blotting unterzogen, um ihren Proteingehalt zu analysieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt,wird der Recycling-Endosomenmarker Rab11 in Fraktion 7<sup class="x…

Discussion

Das obige Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus kultivierten Zellen durch Ultrazentrifugation. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde durch die neueste Veröffentlichung22nachgewiesen, die beweist, dass Recycling-Endosomen erfolgreich aus anderen Organellen (Abbildung 1) wie dem Golgi-Apparat und den Mitochondrien isoliert werden. Einige kritische Schritte müssen beachtet werden, um ein gutes Trennergebnis zu erzielen. Bei d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, des CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt. Die Zahlen in dieser Arbeit wurden aus unserer früheren Publikation “ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1” übernommen, die im Oktober 2020 im FASEB Journal veröffentlicht wurde.

Materials

1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm Beckman Coulter 347287
100 mm tissue culture dish SPL 20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm Beckman Coulter C14277
5x Sample Buffer GenScript MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4850S Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide Sigma-Aldrich C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL DWK Life Sciences 357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose HyClone SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7) Santa Cruz Biotechnology SC-271519 Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
FE65 antibody (E-20) Santa Cruz Biotechnology SC-19751 Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade HyClone SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) Ambion AM4300 Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software Bio-Rad Measurement of band intensity
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody Sigma G6160 Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb Cell Signaling Technology 2276S Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Calbiochem 4010-OP
Optima L-100 XP Beckman Coulter 392050
Optima MAX-TL Beckman Coulter A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media Gibco 31985070
PBS Tablets Gibco 18912014
PhosSTOP Roche 4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody Proteintech 20229-1-AP Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose Affymetrix AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062

References

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Cite This Article
Chan, W. W. R., Zhai, Y. Q., Lau, K. Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (172), e62621, doi:10.3791/62621 (2021).

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